Isolement fécal murin et transplantation de microbiote

Résumé

L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.

Résumé

La dysbiose du microbiote intestinal joue un rôle dans la physiopathologie des troubles cardiovasculaires et métaboliques, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. C’est une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile . Des études précliniques démontrent que la manipulation du microbiote intestinal est un outil utile pour étudier le lien mécaniste entre dysbiose et maladie. La transplantation de microbiote fécal peut aider à élucider de nouvelles thérapies ciblant le microbiote intestinal pour la gestion et le traitement des maladies cardiométaboliques. Malgré un taux de réussite élevé chez les rongeurs, il reste des changements translationnels associés à la transplantation. L’objectif ici est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Dans cette étude, un protocole détaillé pour la collecte, la manipulation, le traitement et la transplantation du microbiote fécal dans les études sur les murins est décrit. Les étapes de collecte et de traitement sont décrites pour les donneurs humains et les rongeurs. Enfin, nous décrivons l’utilisation d’une combinaison des techniques de roulage suisse et d’immunomarquage pour évaluer la morphologie spécifique de l’intestin et les changements d’intégrité dans les maladies cardiovasculaires et les mécanismes connexes du microbiote intestinal.

Introduction

Les troubles cardiométaboliques, y compris les maladies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux, sont les principales causes mondiales de décès¹. L’inactivité physique, une mauvaise alimentation, l’âge avancé et la génétique modulent la physiopathologie de ces troubles. L’accumulation de preuves soutient le concept selon lequel le microbiote intestinal affecte les troubles cardiovasculaires et métaboliques, y compris^{le diabète de} type 2, l’obésité³ et l’hypertension⁴, qui pourraient être essentiels au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies.

Les mécanismes exacts par lesquels le microbiote cause les maladies sont encore inconnus, et les études actuelles sont très variables, en partie en raison de différences méthodologiques. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. La FMT est largement utilisée dans les études animales pour induire ou supprimer un phénotype. Par exemple, l’apport calorique et le métabolisme du glucose peuvent être modulés en transférant des matières fécales d’un donneur malade à un receveur sain ^5,6. Chez l’homme, la FMT s’est avérée être une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile ⁷. Des preuves à l’appui de son utilisation dans la gestion des maladies cardiovasculaires émergent; par exemple, la TMF des patients atteints du syndrome maigre au syndrome métabolique améliore la sensibilité à l’insuline⁸. La dysbiose intestinale est également associée à l’hypertension artérielle dans les études sur les humains et les rongeurs 9,10,11. La TMF de souris nourries avec un régime riche en sel dans des souris exemptes de germes prédispose les receveurs à l’inflammation et à l’hypertension¹².

Malgré le taux élevé de réussite de la FMT chez les rongeurs, des défis de traduction demeurent. Les essais cliniques utilisant la TMF pour traiter l’obésité et le syndrome métabolique indiquent des effets minimes ou nuls sur ces troubles^13,14,15. Ainsi, d’autres études sont nécessaires pour identifier des pistes thérapeutiques supplémentaires ciblant le microbiote intestinal pour le traitement des troubles cardiométaboliques. La plupart des preuves disponibles sur le microbiote intestinal et les maladies cardiovasculaires sont associatives. Le protocole décrit explique comment utiliser une combinaison de FMT et de la technique Swiss-rolling pour montrer à la fois une association entre la maladie et le microbiote intestinal et évaluer directement l’intégrité de toutes les parties de l’intestin^{intestinal 16,17,18}.

L’objectif global de cette méthode est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Ce protocole fournit plus de détails et de considérations clés dans la conception expérimentale pour promouvoir la traduction physiologique et augmenter la rigueur et la reproductibilité des résultats.

Protocole

Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé toutes les procédures décrites dans ce manuscrit. Les souris mâles C57B1/6 âgées de 3 mois, achetées au Jackson Laboratory, ont été hébergées et soignées conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Collecte, entreposage et traitement d’échantillons fécaux humains

1. Prélever un échantillon de selles à l’aide d’un contenant stérile si le sujet est à la clinique. Réfrigérer les échantillons de selles à 4 °C dans les 36 heures suivant le prélèvement jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement. Vous pouvez également prélever des échantillons de selles à l’aide d’un outil disponible dans le commerce pour une stabilité facile et prolongée de l’ADN à température ambiante, en particulier pour une utilisation à domicile.
2. Désinfectez une hotte de niveau de biosécurité avec une solution d’eau de Javel à 10% ou un autre désinfectant approuvé par l’Environmental Protection Agency.
3. Retirer les selles du stockage au frais et les introduire dans la hotte; utiliser une spatule jetable pour faire ~1 g d’aliquotes et conserver dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement prêt pour le traitement.
4. Jetez tous les articles jetables dans les ordures biologiques dangereuses. Désinfectez toutes les surfaces (hotte et toutes les surfaces touchées par le processeur) et les objets retirés de la hotte.

2. Prélèvement aseptique d’échantillons fécaux de souris

REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques, y compris des instruments stérilisés.

1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO₂ . Vaporisez la poitrine et les côtés de la souris avec de l’éthanol à 70% et ouvrez soigneusement la peau et la cavité péritonéale pour exposer le tractus gastro-intestinal.
2. Isolez le caecum et utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour le couper en deux. Brièvement, exposez le caecum et coupez 0,5 cm à proximité de l’iléon et 0,5 cm distalement à sa jonction avec le côlon. Transférer le caecum isolé sur une boîte de Petri stérile.
3. Utiliser une spatule stérile pour transférer le contenu des cæcaux dans des tubes stériles et conserver les aliquotes dans un congélateur à -80 °C¹⁹.
   REMARQUE: Étant donné que la majorité des bactéries dans l’intestin sont anaérobies, l’exposition à l’oxygène peut endommager ou tuer les organismes pendant la procédure d’isolement dans une atmosphère ambiante. Ainsi, les échantillons fécaux doivent être isolés dans des chambres anaérobies pour maintenir la viabilité de la bactérie.

3. Transplantation de matières fécales

1. Resuspendre les granulés fécaux frais ou préalablement congelés dans une solution saline stérile dans une proportion de 1:20 (p:v) et vortex jusqu’à homogénéisation.
2. Passez l’homogénat à travers un filtre en nylon poreux de 30 μm pour éliminer les grosses particules. Centrifuger à 79 × g pendant 5 min et recueillir le surnageant pour l’utiliser pour la transplantation.
3. Gavage oral 100 μL de lisier par souris receveuse exempte de germes pendant 3 jours consécutifs, suivi d’un gavage tous les 3 jours pendant 2 semaines. Utilisez des souris conventionnelles pour étudier les mécanismes du microbiote intestinal si elles ont d’abord été traitées avec des antibiotiques pour éliminer le microbiote endémique du receveur. Par exemple, administrer quotidiennement de la ceftriaxone (400 mg/kg) aux souris receveuses pendant 5 jours consécutifs par gavage oral avant le gavage du lisier fécal.
   NOTE: Des études suggèrent qu’un minimum de 2 semaines de ce traitement est nécessaire pour provoquer des changements cardiovasculaires, y compris la pression artérielle²⁰.
4. S’assurer que les souris receveuses exemptes de germes sont logées seules dans des isolateurs de film gnotobiotique et nourries avec de la nourriture et de l’eau stériles.

4. Mesures de la pression artérielle systolique

REMARQUE: Des souris gnotobiotiques qui ont reçu la FMT de souris C57Bl/6 âgées de 3 mois logées de manière conventionnelle ont été implantées avec des minipompes osmotiques (Alzet, modèle 2002) pour perfusion d’angiotensine II à faible dose (140 ng / kg / min) pendant 2 semaines. La pression artérielle était surveillée chaque semaine par un brassard de queue. Le protocole d’implantation de minipompes osmotiques a déjà été rapporté²¹. Le brassard de queue a été effectué comme brièvement résumé ci-dessous. Une méthode non invasive de mesure de la pression artérielle, telle que le brassard de queue, convient aux études FMT chez les souris gnotobiotiques. Les étapes détaillées sur la façon d’effectuer le brassard de queue ont été décrites précédemment²².

1. Brièvement, récupérez les souris des isolateurs gnotobiotiques et préchauffez la plate-forme de la machine à manchettes de queue et le porte-souris.
2. Placez les souris conscientes dans des dispositifs de contention sur la plate-forme chauffée et recueillez au moins trois séries de mesures de pression systolique en utilisant la pléthysmographie du brassard de queue. Effectuez les étapes suivantes ci-dessous 3 jours consécutifs avant les jours de mesure appropriés, pour entraîner les souris à être retenues afin de réduire le stress.
   1. Placez doucement la souris dans le support préchauffé et laissez la queue à l’extérieur. Collez soigneusement le dessus sans le pincer, afin de ne pas stresser la souris.
   2. Laissez la souris reposer dans le support; Placer sur la plate-forme pendant 3-5 minutes recouvert d’un drap pour acclimater.
3. Faire la moyenne des mesures de toutes les rondes pour une pression systolique moyenne pour chaque animal.

5. Évaluation de la TMF aux changements cardiovasculaires

1. Après la mesure de la pression artérielle, euthanasier les souris et recueillir de manière aseptique le contenu cæcal, comme décrit à la rubrique 2.
2. Récolter les intestins et d’autres tissus, y compris le cœur, l’aorte, le foie, les artères mésentériques et les reins, pour examiner le rôle du microbiote intestinal dans la santé cardiométabolique. Pour prélever des tissus, localisez le tissu dans la souris et utilisez des ciseaux pour les exciser.
3. Effectuer une analyse de séquençage métagénomique sur des échantillons fécaux/contenus cæcaux prélevés sur les souris donneuses et receveuses afin de confirmer la greffe du microbiote intestinal après la FMT²³. La première preuve de la colonisation réussie du microbiote est de confirmer que le microbiote du donneur et du receveur sont similaires.
4. Utiliser la technique Swiss-roll (voir rubrique 6) sur le tissu intestinal récolté, associée à l’immunomarquage et à l’histologie pour examiner les changements morphologiques et d’expression cellulaire²⁴.

6. Faire des Swiss-rolls intestinaux intestinaux

1. Jour 1
   1. Dans une souris correctement euthanasiée pulvérisée avec de l’éthanol à 70%, disséquer l’intestin de la souris du côté anal (fixé dans le rétropéritoine) au côté de l’estomac. Placer la totalité du tractus gastro-intestinal isolé dans une boîte de Petri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Tenez doucement l’extrémité proximale de l’extrémité de l’estomac et retirez la graisse environnante et le tissu conjonctif à la main.
   2. Isolez l’intestin grêle (céphalade de l’appendice) et faites un zigzag de type Z à chaque longueur. Ensuite, couper pour obtenir le duodénum, le jéjunum et l’iléon successivement, comme décrit précédemment²⁵. Isolez le côlon en coupant la section de l’intestin sous le caecum.
   3. Couper le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon.
   4. Rincer et laver l’intestin à l’intérieur à l’aide de PBS avec une seringue et une aiguille avec un bout de bille, afin de ne pas déchirer l’intestin.
   5. Mettez l’intestin sur du papier filtre. Étiquetez le papier avec le nom de la section (p. ex., duodénum), puis « P » dans le coin supérieur droit pour le proximal ou « D » pour le coin inférieur droit.
   6. Couper l’intestin longitudinalement avec des ciseaux à bout de bille. Ouvrez l’intestin sur le papier filtre. Lavez avec plus de PBS au besoin.
   7. Sandwich l’intestin entre deux papiers filtres. Agrafez les papiers filtres en quatre points/coins près de l’intestin.
   8. Faire tremper dans une solution tampon neutre à 10 % de formol (4,0 g de phosphate de sodium monobasique, 6,5 g de phosphate de sodium, dibasique, 100 mL de formaldéhyde à 37 %, 900 mL d’eau distillée). Secouer à l’aide d’une bascule à plate-forme à 5 tr/min à température ambiante pendant la nuit.
2. Jour 2
   1. Préparer l’agarose à 2% dans de l’eau distillée et chauffer avec une barre d’agitation dans un bécher recouvert de papier d’aluminium.
   2. Récupérer les tissus; Dénuder le papier filtre supérieur. Roulez l’intestin du côté proximal de sorte que le côté proximal pénètre d’abord à l’intérieur, et roulez vers l’intérieur pour que la lumière soit également à l’intérieur sur la lame. Épinglez avec une aiguille de 30 G ou deux, au besoin.
   3. Aspirer 1 mL d’agarose à l’aide de pipettes de transfert graduées jetables et verser l’agarose sur une section d’intestin roulé sur une surface plane tout en évitant les bulles d’air dans les tissus.
   4. Laisser l’agarose refroidir et solidifier. Utilisez une lame de rasoir pour couper l’agarose supplémentaire autour de la section de tissu.
   5. Placez les sections intestinales dans des cassettes de traitement / intégration de tissus (plus grandes que les cassettes régulières pour s’adapter à l’augmentation de la hauteur due à l’agarose). Faire tremper dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C.
   6. Préparez des lames de tissus incrustés de paraffine et procédez à l’immunomarquage, comme indiqué ci-dessous.

7. Immunomarquage du tractus intestinal intestinal

1. Désaffinisation
   1. Passez par les bains suivants avec des diapositives dans une grille: xylène pendant 3 min, xylène frais à nouveau pendant 3 min, xylène avec 100% éthanol (1:1) pendant 3 min, éthanol à 95% pendant 3 min, 70% éthanol pendant 3 min et 50% éthanol pendant 3 min.
   2. Rincer doucement à l’eau courante froide du robinet. Conserver dans un bain d’eau du robinet.
2. Récupération d’antigènes
   1. Après la déparaffinisation, faire bouillir les lames dans une grille dans un bain de tampon de récupération d’antigène (citrate trisodique 0,01M dihydraté à pH 6 et 0,05% Tween-20) à 100 °C pendant 20 min.
   2. Courir sous l’eau froide du robinet.
3. Coloration
   1. Retirez les lames du bain et placez le mouchoir face vers le haut dans une boîte à coulissants avec des lingettes de laboratoire humides / serviettes en papier dans le fond. Dessinez un contour autour du tissu avec un marqueur hydrophobe.
   2. Déposer la solution saline tamponnée Tris (TBS) + 0,025% Triton X-100 sur le tissu et incuber pendant 5 min. Répétez cette étape.
   3. Bloquer avec TBS + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) + 1% d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 2 h à température ambiante. Tournez les lames sur le côté et retirez la mémoire tampon de blocage sur une lingette de laboratoire.
   4. Ajouter la solution d’anticorps primaires et incuber à 4 °C pendant au moins 2 h ou toute la nuit. Laver doucement avec TBS + 0,025% Triton X-100 en pipetant doucement ~200 μL sur la section.
   5. Ajouter la solution d’anticorps secondaires et incuber pendant 1 h à température ambiante. Rincer les lames 3 x 5 min avec TBS en les rinçant à la pipette, comme à l’étape 7.3.4.
   6. Montage avec support de montage et couvercle.

Résultats

Les étapes décrites ci-dessus sont résumées à la figure 1. Le contenu des cæcaux de souris ou les excréments humains sont remis en suspension dans une solution saline stérile pour préparer une suspension à donner à des souris exemptes de germes (100 μL) par gavage, d’abord pendant 3 jours consécutifs, puis une fois tous les 3 jours. À la fin du protocole, la pression artérielle est mesurée par la méthode du brassard de queue, les souris sont euthanasiées et les tissus son...

Discussion

Une approche utile pour étudier le rôle causal du microbiote intestinal dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques consiste à transférer le microbiote total ou certaines espèces d’intérêt chez des souris exemptes de germes. Ici, nous décrivons des protocoles pour collecter des échantillons fécaux chez l’homme et des souris logées de manière conventionnelle dans des souris exemptes de germes afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans les troubles hypertensifs.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter (30 µm)	Fisher Scientific	NC0922459
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4