Isolamento fecale murino e trapianto di microbiota

Riepilogo

L'obiettivo qui è quello di delineare un protocollo per studiare i meccanismi della disbiosi nelle malattie cardiovascolari. Questo documento discute come raccogliere e trapiantare asetticamente campioni fecali murini, isolare l'intestino e utilizzare il metodo "Swiss-roll", seguito da tecniche di immunocolorazione per interrogare i cambiamenti nel tratto gastrointestinale.

Abstract

La disbiosi del microbiota intestinale svolge un ruolo nella fisiopatologia dei disturbi cardiovascolari e metabolici, ma i meccanismi non sono ben compresi. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un approccio prezioso per delineare un ruolo diretto del microbiota totale o delle specie isolate nella fisiopatologia della malattia. È un'opzione di trattamento sicura per i pazienti con infezione ricorrente da Clostridium difficile . Studi preclinici dimostrano che la manipolazione del microbiota intestinale è uno strumento utile per studiare il legame meccanicistico tra disbiosi e malattia. Il trapianto di microbiota fecale può aiutare a chiarire nuove terapie mirate al microbiota intestinale per la gestione e il trattamento della malattia cardiometabolica. Nonostante un alto tasso di successo nei roditori, rimangono cambiamenti traslazionali associati al trapianto. L'obiettivo qui è quello di fornire una guida nello studio degli effetti del microbioma intestinale nella malattia cardiovascolare sperimentale. In questo studio, viene descritto un protocollo dettagliato per la raccolta, la manipolazione, l'elaborazione e il trapianto del microbiota fecale negli studi murini. Le fasi di raccolta e lavorazione sono descritte sia per i donatori umani che per i roditori. Infine, descriviamo l'utilizzo di una combinazione delle tecniche Swiss-rolling e immunostaining per valutare la morfologia specifica dell'intestino e i cambiamenti di integrità nelle malattie cardiovascolari e nei relativi meccanismi del microbiota intestinale.

Introduzione

I disturbi cardiometabolici, tra cui malattie cardiache e ictus, sono le principali cause globali di morte¹. L'inattività fisica, la cattiva alimentazione, l'avanzare dell'età e la genetica modulano la fisiopatologia di questi disturbi. L'accumulo di prove supporta il concetto che il microbiota intestinale influenzi i disturbi cardiovascolari e metabolici, tra cui il diabete di tipo 2², l'obesità³ e l'ipertensione⁴, che possono essere la chiave per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per queste malattie.

I meccanismi esatti con cui il microbiota causa malattie sono ancora sconosciuti e gli studi attuali sono altamente variabili, in parte a causa delle differenze metodologiche. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un approccio prezioso per delineare un ruolo diretto del microbiota totale o delle specie isolate nella fisiopatologia della malattia. FMT è ampiamente usato negli studi sugli animali per indurre o sopprimere un fenotipo. Ad esempio, l'apporto calorico e il metabolismo del glucosio possono essere modulati trasferendo materia fecale da un donatore malato a un ricevente sano ^5,6. Nell'uomo, FMT ha dimostrato di essere un'opzione di trattamento sicuro per i pazienti con infezione ricorrente da Clostridium difficile ⁷. Stanno emergendo prove a sostegno del suo uso nella gestione delle malattie cardiovascolari; ad esempio, FMT da pazienti magri a pazienti con sindrome metabolica migliora la sensibilità all'insulina⁸. La disbiosi intestinale è anche associata ad alta pressione sanguigna negli studi sia sull'uomo che sui roditori 9,10,11. FMT da topi alimentati con una dieta ricca di sale in topi privi di germi predispone i riceventi all'infiammazione e all'ipertensione¹².

Nonostante l'alto tasso di successo dell'FMT nei roditori, permangono sfide traslazionali. Gli studi clinici che utilizzano FMT per trattare l'obesità e la sindrome metabolica indicano effetti minimi o nulli su questi disturbi^13,14,15. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per identificare ulteriori vie terapeutiche mirate al microbiota intestinale per il trattamento dei disturbi cardiometabolici. La maggior parte delle prove disponibili sul microbiota intestinale e sulle malattie cardiovascolari è associativa. Il protocollo descritto discute come utilizzare una combinazione di FMT e la tecnica Swiss-rolling per mostrare sia un'associazione tra malattia e microbiota intestinale sia valutare direttamente l'integrità di tutte le parti dell'intestino^{intestinale 16,17,18}.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida per lo studio degli effetti del microbioma intestinale nella malattia cardiovascolare sperimentale. Questo protocollo fornisce maggiori dettagli e considerazioni chiave nel disegno sperimentale per promuovere la traduzione fisiologica e aumentare il rigore e la riproducibilità dei risultati.

Protocollo

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Vanderbilt University ha approvato tutte le procedure descritte in questo manoscritto. I topi maschi C57B1/6 a 3 mesi di età, acquistati dal Jackson Laboratory, sono stati ospitati e curati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Raccolta, conservazione ed elaborazione di campioni fecali umani

1. Raccogliere un campione di feci, utilizzando un contenitore sterile se il soggetto è in clinica. Refrigerare i campioni di feci a 4 °C entro 36 ore dalla raccolta fino al momento della lavorazione. In alternativa, raccogliere campioni di feci utilizzando uno strumento disponibile in commercio per una stabilità del DNA facile ed estesa a temperatura ambiente, in particolare per l'uso domestico.
2. Disinfettare una cappa aspirante a livello di biosicurezza con una soluzione di candeggina al 10% o altro disinfettante approvato dall'Agenzia per la protezione dell'ambiente.
3. Rimuovere le feci dal deposito frigorifero e portarle nella cappa aspirante; utilizzare una spatola monouso per preparare ~1 g di aliquote e conservare in un congelatore a -80 °C fino a completa preparazione per la lavorazione.
4. Getta tutti gli oggetti usa e getta nella spazzatura a rischio biologico. Disinfettare tutte le superfici (cappuccio e tutte le superfici toccate dal processore) e gli oggetti rimossi dalla cappa.

2. Raccolta asettica di campioni fecali di topo

NOTA: Utilizzare tecniche asettiche, compresi strumenti sterilizzati.

1. Eutanasia del topo mediante asfissia da CO₂ . Spruzzare il torace e i lati del topo con etanolo al 70% e aprire con attenzione la pelle e la cavità peritoneale per esporre il tratto gastrointestinale.
2. Isolare il cieco e usare forbici chirurgiche sterili per tagliarlo a metà. Brevemente, esporre il cieco e tagliare 0,5 cm prossimalmente dall'ileo e 0,5 cm distalmente alla sua giunzione con il colon. Trasferire il cieco isolato su una capsula di Petri sterile.
3. Utilizzare una spatola sterile per trasferire il contenuto cecale in tubi sterili e conservare le aliquote in un congelatore a -80 °C¹⁹.
   NOTA: Poiché la maggior parte dei batteri nell'intestino sono anaerobi, l'esposizione all'ossigeno può danneggiare o uccidere gli organismi durante la procedura di isolamento in un'atmosfera ambiente. Pertanto, i campioni fecali devono essere isolati in camere anaerobiche per mantenere la vitalità dei batteri.

3. Trapianto di materia fecale

1. Risospendere i pellet fecali freschi o precedentemente congelati in soluzione salina sterile in proporzione 1:20 (w:v) e vortice fino a omogeneizzazione.
2. Far passare l'omogenato attraverso un filtro in nylon poroso da 30 μm per rimuovere il particolato di grandi dimensioni. Centrifugare a 79 × g per 5 minuti e raccogliere il surnatante da utilizzare per il trapianto.
3. Rapina orale 100 μL di liquame per topo ricevente privo di germi per 3 giorni consecutivi, seguita da sonda gastrica ogni 3 giorni per 2 settimane. Utilizzare topi convenzionali per studiare i meccanismi del microbiota intestinale se sono stati prima trattati con antibiotici per eliminare il microbiota endemico del ricevente. Ad esempio, somministrare ceftriaxone (400 mg / kg) al giorno ai topi riceventi per 5 giorni consecutivi mediante sonda gastrica orale prima della sonda fecale.
   NOTA: Gli studi suggeriscono che è necessario un minimo di 2 settimane di questo trattamento per suscitare cambiamenti cardiovascolari, compresa la pressione sanguigna²⁰.
4. Assicurarsi che i topi riceventi privi di germi siano alloggiati singolarmente in isolatori di film gnotobiotici e nutriti con cibo e acqua sterili.

4. Misurazioni della pressione arteriosa sistolica

NOTA: Topi gnotobiotici che hanno ricevuto FMT da topi C57Bl/6 di 3 mesi alloggiati convenzionalmente sono stati impiantati con minipompe osmotiche (Alzet, modello 2002) per infusione di angiotensina II a basso dosaggio (140 ng/kg/min) per 2 settimane. La pressione sanguigna è stata monitorata settimanalmente tramite bracciale della coda. Il protocollo per l'impianto di minipompe osmotiche è stato precedentemente riportato²¹. Il bracciale della coda è stato eseguito come brevemente riassunto di seguito. Un metodo non invasivo per misurare la pressione sanguigna, come la cuffia della coda, è adatto per gli studi FMT nei topi gnotobiotici. I passaggi dettagliati su come eseguire il bracciale della coda sono stati descritti in precedenza²².

1. In breve, recuperare i topi dagli isolatori gnotobiotici e preriscaldare la piattaforma della macchina della cuffia della coda e il supporto del mouse.
2. Posizionare i topi coscienti in restrizioni sulla piattaforma riscaldata e raccogliere almeno tre cicli di misurazioni della pressione sistolica utilizzando la pletismografia della cuffia della coda. Eseguire i seguenti passaggi di seguito per 3 giorni consecutivi prima dei giorni di misurazione corretti, per addestrare i topi ad essere trattenuti al fine di ridurre lo stress.
   1. Posizionare delicatamente il mouse nel supporto preriscaldato e lasciare la coda all'esterno. Fissare con attenzione la parte superiore senza pizzicarla, in modo da non stressare il mouse.
   2. Lasciare riposare il mouse nel supporto; Posizionare sulla piattaforma per 3-5 minuti coperto da un lenzuolo per acclimatarsi.
3. Media delle misurazioni di tutti i cicli per una pressione sistolica media per ciascun animale.

5. Valutazione dell'FMT alle alterazioni cardiovascolari

1. Dopo la misurazione della pressione arteriosa, eutanasia i topi e raccogliere asetticamente il contenuto cecale, come descritto nella sezione 2.
2. Raccogliere l'intestino e altri tessuti, tra cui il cuore, l'aorta, il fegato, le arterie mesenteriche e i reni, per esaminare il ruolo del microbiota intestinale nella salute cardiometabolica. Per raccogliere i tessuti, individuare il tessuto nel topo e usare le forbici per asportarle.
3. Eseguire un'analisi di sequenziamento metagenomico su campioni fecali / contenuti cecali raccolti dai topi donatori e riceventi per confermare l'attecchimento del microbiota intestinale dopo FMT²³. La prima prova del successo della colonizzazione del microbiota è la conferma che il microbiota del donatore e del ricevente sono simili.
4. Utilizzare la tecnica Swiss-roll (vedere paragrafo 6) sul tessuto intestinale prelevato, associata a immunocolorazione e istologia per esaminare i cambiamenti morfologici e di espressione cellulare²⁴.

6. Fare l'intestino intestinale Swiss-rolls

1. Giorno 1
   1. In un topo correttamente eutanasia spruzzato con etanolo al 70%, sezionare l'intestino del topo dal lato anale (fissato nel retroperitoneo) al lato dello stomaco. Posizionare l'intero tratto gastrointestinale isolato in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Tenere delicatamente l'estremità prossimale dall'estremità dello stomaco e rimuovere il grasso circostante e il tessuto connettivo a mano.
   2. Isolare l'intestino tenue (cefalea dall'appendice) e fare uno zigzag di tipo Z con ogni lunghezza. Quindi, tagliare per ottenere successivamente il duodeno, il digiuno e l'ileo, come descritto in precedenza²⁵. Isolare il colon tagliando la sezione dell'intestino sotto il cieco.
   3. Tagliare il duodeno, il digiuno, l'ileo e il colon.
   4. Lavare e lavare l'intestino all'interno usando PBS con una siringa e un ago con una punta a sfera, in modo da non strappare l'intestino.
   5. Metti l'intestino sulla carta da filtro. Etichetta la carta con il nome della sezione (ad esempio, duodeno) e poi "P" nell'angolo in alto a destra per prossimale o "D" per distale nell'angolo in basso a destra.
   6. Tagliare l'intestino longitudinalmente con le forbici a sfera. Apri l'intestino sulla carta da filtro. Lavare con più PBS secondo necessità.
   7. Inserire il budello tra due carte da filtro. Pinzate le carte da filtro in quattro punti/angoli vicino all'intestino.
   8. Immergere in una soluzione tampone neutra di formalina al 10% (4,0 g di fosfato di sodio, monobasico, 6,5 g di fosfato di sodio, bibasico, 100 ml di formaldeide al 37%, 900 ml di acqua distillata). Agitare con un bilanciere a piattaforma a 5 giri / min a temperatura ambiente durante la notte.
2. Giorno 2
   1. Preparare il 2% di agarosio in acqua distillata e scaldare con un mescolatore in un becher coperto con un foglio di alluminio.
   2. Recuperare i tessuti; Striscia la carta da filtro superiore. Rotolare l'intestino dal lato prossimale in modo che il lato prossimale entri prima e rotolare verso l'interno in modo che il lume sia anche all'interno del vetrino. Pin con un ago da 30 G o due, se necessario.
   3. Aspirare 1 mL di agarosio utilizzando pipette transfer monouso e versare l'agarosio su una sezione di budello arrotolata su una superficie piana evitando bolle d'aria nei tessuti.
   4. Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio. Usa una lametta per tagliare l'agarosio extra intorno alla sezione del tessuto.
   5. Metti le sezioni intestinali in cassette di lavorazione / incorporamento dei tessuti (più grandi di quelle normali per adattarsi all'altezza aumentata dovuta all'agarosio). Immergere in etanolo al 70% a 4 °C.
   6. Preparare vetrini di tessuto incorporati in paraffina e procedere all'immunocolorazione, come descritto di seguito.

7. Immunocolorazione del tratto intestinale intestinale

1. Deparaffinizzazione
   1. Passare attraverso i seguenti bagni con vetrini in una griglia: xilene per 3 minuti, xilene fresco di nuovo per 3 minuti, xilene con etanolo al 100% (1:1) per 3 minuti, etanolo al 95% per 3 minuti, etanolo al 70% per 3 minuti e etanolo al 50% per 3 minuti.
   2. Risciacquare delicatamente con acqua corrente fredda del rubinetto. Conservare in un bagno di acqua del rubinetto.
2. Recupero dell'antigene
   1. Dopo la deparaffinizzazione, far bollire i vetrini in una griglia in un bagno di tampone di recupero dell'antigene (0,01 M citrato trisodico diidrato a pH 6 e 0,05% Tween-20) a 100 °C per 20 minuti.
   2. Corri sotto l'acqua fredda del rubinetto.
3. Macchiatura
   1. Rimuovere i vetrini dal bagno e posizionare il fazzoletto a faccia in su in una scatola di vetrini con salviette da laboratorio umidificate / asciugamani di carta sul fondo. Disegna un contorno intorno al tessuto con un pennarello idrofobo.
   2. Far cadere la soluzione salina tamponata Tris (TBS) + 0,025% Triton X-100 sul tessuto e incubare per 5 minuti. Ripetere questo passaggio.
   3. Bloccare con TBS + 10% siero bovino fetale (FBS) + 1% albumina sierica bovina (BSA) per 2 ore a temperatura ambiente. Ruotare i vetrini su un lato e rimuovere il buffer di blocco su una salvietta da laboratorio.
   4. Aggiungere la soluzione anticorpale primaria e incubare a 4 °C per almeno 2 ore o durante la notte. Lavare delicatamente con TBS + 0,025% Triton X-100 pipettando delicatamente ~200 μL sulla sezione.
   5. Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Risciacquare i vetrini 3 x 5 minuti con TBS risciacquando con una pipetta, come al punto 7.3.4.
   6. Montare con supporto di montaggio e una slitta di copertura.

Risultati

I passaggi descritti in precedenza sono riepilogati nella Figura 1. Il contenuto cecale del topo o le feci umane vengono risospesi in soluzione salina sterile per preparare un impasto da somministrare ai topi privi di germi (100 μL) mediante sonda gastrica, prima per 3 giorni consecutivi, poi una volta ogni 3 giorni. Alla fine del protocollo, la pressione sanguigna viene misurata con il metodo della coda, i topi vengono eutanizzati e i tessuti vengono raccolti per la valutazione dei cambiam...

Discussione

Un valido approccio per studiare il ruolo causale del microbiota intestinale nelle malattie cardiovascolari e metaboliche è quello di trasferire il microbiota totale o selezionare le specie di interesse in topi privi di germi. Qui, descriviamo i protocolli per raccogliere campioni fecali da esseri umani e topi ospitati convenzionalmente in topi privi di germi per studiare il ruolo del microbiota intestinale nei disturbi ipertensivi.

Nei topi, usiamo contenuti cecali raccolti asetticamente ela...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4