Fäkalisolierung der Maus und Mikrobiota-Transplantation

Zusammenfassung

Ziel ist es, ein Protokoll zu skizzieren, um die Mechanismen der Dysbiose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Artikel wird erörtert, wie man aseptisch Stuhlproben von Mäusen sammelt und transplantiert, Darm isoliert und die "Swiss-Roll"-Methode anwendet, gefolgt von Immunfärbetechniken, um Veränderungen im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Dysbiose der Darmmikrobiota spielt eine Rolle in der Pathophysiologie von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. Es ist eine sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion . Präklinische Studien zeigen, dass die Manipulation der Darmmikrobiota ein nützliches Werkzeug ist, um den mechanistischen Zusammenhang zwischen Dysbiose und Krankheit zu untersuchen. Die Transplantation fäkaler Mikrobiota könnte dazu beitragen, neuartige Therapeutika für die Behandlung und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln, die auf die Darmmikrobiota ausgerichtet sind. Trotz einer hohen Erfolgsrate bei Nagetieren bleiben mit der Transplantation translationale Veränderungen verbunden. Ziel ist es, eine Orientierungshilfe bei der Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms auf experimentelle Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll für die Sammlung, Handhabung, Verarbeitung und Transplantation von fäkalen Mikrobiota in murinen Studien beschrieben. Die Entnahme- und Verarbeitungsschritte werden sowohl für menschliche als auch für Nagetierspender beschrieben. Abschließend beschreiben wir die Verwendung einer Kombination aus Swiss-Rolling- und Immunfärbetechniken zur Beurteilung darmspezifischer Morphologie- und Integritätsveränderungen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und damit verbundenen Mechanismen der Darmmikrobiota.

Einleitung

Kardiometabolische Erkrankungen, einschließlich Herzerkrankungen und Schlaganfall, sind weltweit die häufigsten Todesursachen¹. Körperliche Inaktivität, schlechte Ernährung, fortschreitendes Alter und Genetik modulieren die Pathophysiologie dieser Störungen. Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass die Darmmikrobiota Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes², Fettleibigkeit³ und Bluthochdruck⁴ beeinflusst, was ein Schlüssel zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Krankheiten sein könnte.

Die genauen Mechanismen, durch die die Mikrobiota Krankheiten verursacht, sind noch unbekannt, und die aktuellen Studien sind sehr unterschiedlich, was zum Teil auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. FMT wird häufig in Tierversuchen eingesetzt, um einen Phänotyp zu induzieren oder zu unterdrücken. Zum Beispiel können die Kalorienaufnahme und der Glukosestoffwechsel moduliert werden, indem Fäkalien von einem kranken Spender auf einen gesunden Empfänger übertragen werden ^5,6. Beim Menschen hat sich FMT als sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion erwiesen⁷. Es gibt Beweise für seine Verwendung bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Zum Beispiel verbessert FMT von Patienten mit magerem bis metabolischem Syndrom die Insulinsensitivität⁸. Darmdysbiose wird sowohl in Human- als auch in Nagetierstudien auch mit Bluthochdruck in Verbindung gebracht 9,10,11. FMT von Mäusen, die mit einer salzreichen Diät in keimfreie Mäuse gefüttert wurden, prädisponiert die Empfänger für Entzündungen und Bluthochdruck¹².

Trotz der hohen Erfolgsrate der FMT bei Nagetieren bleiben translationale Herausforderungen bestehen. Klinische Studien mit FMT zur Behandlung von Adipositas und metabolischem Syndrom zeigen minimale bis keine Auswirkungen auf diese Erkrankungen^13,14,15. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zusätzliche therapeutische Wege zu identifizieren, die auf die Darmmikrobiota zur Behandlung von kardiometabolischen Störungen abzielen. Die meisten verfügbaren Erkenntnisse über die Darmmikrobiota und Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind assoziativ. Das beschriebene Protokoll erörtert, wie eine Kombination aus FMT und der Swiss-Rolling-Technik verwendet werden kann, um sowohl einen Zusammenhang zwischen Krankheit und Darmmikrobiota aufzuzeigen als auch die Integrität aller Teile des Darms direkt zu beurteilen^16,17,18.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine Anleitung für die Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms bei experimentellen Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. Dieses Protokoll enthält weitere Details und wichtige Überlegungen im Versuchsdesign, um die physiologische Translation zu fördern und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen.

Protokoll

Das Institutional Animal Care and Use Committee der Vanderbilt University genehmigte alle in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren. C57B1/6 männliche Mäuse im Alter von 3 Monaten, die vom Jackson Laboratory gekauft wurden, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht und gepflegt.

1. Sammlung, Lagerung und Verarbeitung menschlicher Kotproben

1. Entnehmen Sie eine Stuhlprobe in einem sterilen Behälter, wenn sich die Person in der Klinik befindet. Kühlen Sie die Stuhlproben innerhalb von 36 Stunden nach der Entnahme bei 4 °C, bis sie für die Verarbeitung bereit sind. Alternativ können Stuhlproben mit einem handelsüblichen Gerät entnommen werden, um eine einfache und erweiterte DNA-Stabilität bei Raumtemperatur zu gewährleisten, insbesondere für den Heimgebrauch.
2. Desinfizieren Sie einen Abzug mit biologischer Sicherheit mit einer 10%igen Bleichlösung oder einem anderen von der Environmental Protection Agency zugelassenen Desinfektionsmittel.
3. Nehmen Sie den Hocker aus der kühlen Lagerung und bringen Sie ihn in den Abzug. Verwenden Sie einen Einwegspatel, um ~1 g Aliquots herzustellen, und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -80 °C, bis sie vollständig verarbeitet werden können.
4. Entsorgen Sie alle Einwegartikel im Müll für biologische Gefahren. Desinfizieren Sie alle Oberflächen (Dunstabzugshaube und alle vom Prozessor berührten Oberflächen) und Gegenstände, die von der Haube entfernt werden.

2. Aseptische Entnahme von Stuhlproben von Mäusen

Anmerkungen: Verwenden Sie aseptische Techniken, einschließlich sterilisierter Instrumente.

1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO_{2 -} Erstickung. Besprühen Sie die Brust und die Seiten der Maus mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie vorsichtig die Haut und die Bauchhöhle, um den Magen-Darm-Trakt freizulegen.
2. Isolieren Sie den Blinddarm und schneiden Sie ihn mit einer sterilen chirurgischen Schere in zwei Hälften. Legen Sie den Blinddarm kurz frei und schneiden Sie 0,5 cm proximal vom Ileum und 0,5 cm distal an seinem Übergang zum Dickdarm ab. Übertragen Sie den isolierten Blinddarm in eine sterile Petrischale.
3. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um den Blinddarminhalt in sterile Röhrchen umzufüllen, und lagern Sie Aliquote in einem Gefrierschrank bei -80 °C¹⁹.
   Anmerkungen: Da die meisten Bakterien im Darm anaerob sind, kann die Einwirkung von Sauerstoff die Organismen während des Isolationsvorgangs in Raumatmosphäre schädigen oder abtöten. Daher sollten Kotproben in anaeroben Kammern isoliert werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu erhalten.

3. Transplantation von Fäkalien

1. Frische oder zuvor gefrorene Kotpellets in steriler Kochsalzlösung im Verhältnis 1:20 (w:v) resuspendieren und bis zur Homogenisierung vortexen.
2. Führen Sie das Homogenat durch einen Nylonfilter mit 30 μm-Poren, um große Partikel zu entfernen. Bei 79 × g für 5 min zentrifugieren und den Überstand für die Transplantation auffangen.
3. Orale Sonde 100 μl der Aufschlämmung pro keimfreier Empfängermaus an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gefolgt von Sonde alle 3 Tage für 2 Wochen. Verwenden Sie herkömmliche Mäuse, um die Mechanismen der Darmmikrobiota zu untersuchen, wenn sie zuerst mit Antibiotika behandelt wurden, um die eigene endemische Mikrobiota des Empfängers zu eliminieren. Verabreichen Sie den Empfängermäusen beispielsweise Ceftriaxon (400 mg/kg) täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen über eine orale Sonde vor der Sonde der Stuhlaufschlämmung.
   HINWEIS: Studien deuten darauf hin, dass mindestens 2 Wochen dieser Behandlung erforderlich sind, um kardiovaskuläre Veränderungen, einschließlich Blutdruck, hervorzurufen²⁰.
4. Stellen Sie sicher, dass keimfreie Empfängermäuse in gnotobiotischen Filmisolatoren untergebracht und mit sterilem Futter und Wasser gefüttert werden.

4. Systolische Blutdruckmessungen

HINWEIS: Gnotobiotische Mäuse, die FMT von konventionell gehaltenen 3 Monate alten C57Bl/6-Mäusen erhielten, wurden mit osmotischen Minipumpen (Alzet, Modell 2002) zur Infusion von niedrig dosiertem Angiotensin II (140 ng/kg/min) für 2 Wochen implantiert. Der Blutdruck wurde wöchentlich über die Schwanzmanschette überwacht. Über das Protokoll für die Implantation osmotischer Minipumpen wurde bereits berichtet²¹. Die Schwanzmanschette wurde wie unten kurz zusammengefasst durchgeführt. Eine nicht-invasive Methode zur Blutdruckmessung, wie z. B. die Schwanzmanschette, eignet sich für FMT-Studien an gnotobiotischen Mäusen. Die detaillierten Schritte zur Durchführung der Schweifmanschette wurden bereits^{beschrieben 22}.

1. Holen Sie die Mäuse kurz aus den gnotobiotischen Isolatoren und heizen Sie die Plattform der Schwanzmanschette und den Maushalter vor.
2. Legen Sie die bewussten Mäuse in Fesseln auf die beheizte Plattform und sammeln Sie mindestens drei Runden systolischer Druckmessungen mittels Schwanzmanschettenplethysmographie. Führen Sie die folgenden Schritte an 3 aufeinanderfolgenden Tagen vor den richtigen Messtagen durch, um Mäusen beizubringen, gefesselt zu werden, um Stress abzubauen.
   1. Legen Sie die Maus vorsichtig in die vorgeheizte Halterung und lassen Sie den Schwanz draußen. Kleben Sie die Oberseite vorsichtig ab, ohne sie zu drücken, um die Maus nicht zu belasten.
   2. Lassen Sie die Maus in der Halterung ruhen. 3-5 Minuten mit einem Laken bedeckt auf die Plattform legen, um sich zu akklimatisieren.
3. Ermitteln Sie den Mittelwert der Messwerte aus allen Runden, um einen durchschnittlichen systolischen Druck für jedes Tier zu ermitteln.

5. Beurteilung der FMT auf kardiovaskuläre Veränderungen

1. Nach der Blutdruckmessung werden die Mäuse eingeschläfert und der Blinddarminhalt aseptisch entnommen, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
2. Entnahme des Darms und anderer Gewebe, einschließlich Herz, Aorta, Leber, Mesenterialarterien und Nieren, um die Rolle der Darmmikrobiota für die kardiometabolische Gesundheit zu untersuchen. Um Gewebe zu entnehmen, lokalisieren Sie das Gewebe in der Maus und entfernen Sie es mit einer Schere.
3. Führen Sie eine metagenomische Sequenzierungsanalyse an Stuhlproben/Blinddarminhalten durch, die von den Spender- und Empfängermäusen entnommen wurden, um die Transplantation der Darmmikrobiota nach FMT²³ zu bestätigen. Der erste Beweis für eine erfolgreiche Besiedlung der Mikrobiota ist die Bestätigung, dass die Mikrobiota des Spenders und des Empfängers ähnlich ist.
4. Verwenden Sie die Swiss-Roll-Technik (siehe Abschnitt 6) auf dem entnommenen Darmgewebe in Verbindung mit Immunfärbung und Histologie, um morphologische und zelluläre Expressionsveränderungen zu untersuchen²⁴.

6. Darm-Darm-Brötchen herstellen

1. Tag 1
   1. Bei einer ordnungsgemäß euthanasierten Maus, die mit 70%igem Ethanol besprüht wurde, präparieren Sie den Mäusedarm von der Analseite (fixiert im Retroperitoneum) bis zur Magenseite. Legen Sie den gesamten isolierten Magen-Darm-Trakt in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Halten Sie das proximale Ende sanft vom Bauchende ab und entfernen Sie das umgebende Fett und Bindegewebe mit der Hand.
   2. Isolieren Sie den Dünndarm (Cephalad vom Blinddarm) und machen Sie mit jeder Länge ein Zickzack vom Typ Z. Schneiden Sie dann, um nacheinander den Zwölffingerdarm, das Jejunum und das Ileum zu erhalten, wie zuvor beschrieben²⁵. Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie den Darmabschnitt unterhalb des Blinddarms durchtrennen.
   3. Schneiden Sie den Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm durch.
   4. Spülen und waschen Sie den Darm innen mit PBS mit einer Spritze und einer Nadel mit Kugelspitze, um den Darm nicht zu zerreißen.
   5. Legen Sie den Darm auf Filterpapier. Beschriften Sie das Papier mit dem Namen des Abschnitts (z. B. Zwölffingerdarm) und dann "P" in der rechten oberen Ecke für proximal oder "D" für distal in der rechten unteren Ecke.
   6. Schneiden Sie den Darm mit einer Kugelschere in Längsrichtung durch. Öffnen Sie den Darm auf dem Filterpapier. Nach Bedarf mit mehr PBS waschen.
   7. Klemme den Darm zwischen zwei Filterpapiere. Tackern Sie die Filterpapiere an vier Punkten/Ecken in der Nähe des Darms.
   8. In 10%iger formalinneutraler Pufferlösung (4,0 g einbasisches Natriumphosphat, 6,5 g Natriumphosphat, zweibasisch, 100 ml 37%iges Formaldehyd, 900 ml destilliertes Wasser) einweichen. Mit einer Plattformwippe bei 5 U/min bei Raumtemperatur über Nacht schütteln.
2. Tag 2
   1. 2% Agarose in destilliertem Wasser zubereiten und mit einem Rührstab in einem mit Alufolie abgedeckten Becherglas erhitzen.
   2. Holen Sie die Taschentücher zurück; Ziehen Sie das obere Filterpapier ab. Rollen Sie den Darm von der proximalen Seite, so dass die proximale Seite zuerst nach innen geht, und rollen Sie ihn nach innen, so dass sich das Lumen auch auf dem Objektträger befindet. Je nach Bedarf mit einer oder zwei 30-G-Nadeln feststecken.
   3. Aspirieren Sie 1 ml Agarose mit Einweg-Transferpipetten und gießen Sie die Agarose auf einen gerollten Darmabschnitt auf einer ebenen Oberfläche, wobei Luftblasen im Gewebe vermieden werden.
   4. Lassen Sie die Agarose abkühlen und fest werden. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die überschüssige Agarose um den Gewebeabschnitt herum zu schneiden.
   5. Legen Sie die Darmabschnitte in Gewebeverarbeitungs-/Einbettungskassetten (größer als die normalen, um die erhöhte Höhe durch Agarose aufzunehmen). In 70%igem Ethanol bei 4 °C einweichen.
   6. Bereiten Sie in Paraffin eingebettete Gewebeobjektträger vor und fahren Sie mit der Immunfärbung fort, wie unten beschrieben.

7. Immunfärbung des Darm-Darm-Traktes

1. Entparaffinierung
   1. Durchlaufen Sie die folgenden Bäder mit Objektträgern in einem Gestell: Xylol für 3 min, frisches Xylol erneut für 3 min, Xylol mit 100 % Ethanol (1:1) für 3 min, 95 % Ethanol für 3 min, 70 % Ethanol für 3 min und 50 % Ethanol für 3 min.
   2. Vorsichtig mit kaltem, fließendem Leitungswasser abspülen. In einem Bad mit Leitungswasser aufbewahren.
2. Antigen-Entnahme
   1. Nach der Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Gestell in einem Bad mit Antigen-Retrieval-Puffer (0,01 M Trinatriumcitrat-Dihydrat bei pH 6 und 0,05 % Tween-20) bei 100 °C für 20 min gekocht.
   2. Unter kaltem Leitungswasser laufen lassen.
3. Färbung
   1. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Bad und legen Sie das Taschentuch mit der Vorderseite nach oben in einen Objektträgerkasten mit feuchten Labortüchern/Papiertüchern im Boden. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierungsstift einen Umriss um das Gewebe herum.
   2. Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,025 % Triton X-100 auf das Gewebe geben und 5 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   3. Blockieren Sie mit TBS + 10 % fetalem Kälberserum (FBS) + 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 2 h bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Objektträger auf die Seite und entfernen Sie den Blockierpuffer auf einem Labortuch.
   4. Primäre Antikörperlösung zugeben und bei 4 °C für mindestens 2 h oder über Nacht inkubieren. Waschen Sie vorsichtig mit TBS + 0,025 % Triton X-100, indem Sie vorsichtig ~200 μl über den Abschnitt pipettieren.
   5. Sekundäre Antikörperlösung zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie die Objektträger 3 x 5 Minuten mit TBS, indem Sie sie mit einer Pipette spülen, wie in Schritt 7.3.4 beschrieben.
   6. Befestigung mit Montagemedium und Deckglas.

Ergebnisse

Die oben beschriebenen Schritte sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Der Blinddarminhalt der Maus oder der menschliche Kot wird in steriler Kochsalzlösung resuspendiert, um eine Aufschlämmung herzustellen, die keimfreien Mäusen (100 μl) per Sonde verabreicht wird, zuerst an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, dann einmal alle 3 Tage. Am Ende des Protokolls wird der Blutdruck mit der Schwanzmanschettenmethode gemessen, Mäuse werden eingeschläfert und Gewebe entnommen, um Veränderungen der Da...

Diskussion

Ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der kausalen Rolle der Darmmikrobiota bei Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen besteht darin, die gesamte Mikrobiota oder ausgewählte Arten von Interesse auf keimfreie Mäuse zu übertragen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Entnahme von Kotproben von Menschen und konventionell untergebrachten Mäusen in keimfreie Mäuse, um die Rolle der Darmmikrobiota bei Bluthochdruckerkrankungen zu untersuchen.

Bei Mäusen verwenden wir aseptisch gesammelte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter (30 µm)	Fisher Scientific	NC0922459
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4