マウス糞便分離と微生物叢移植

要約

ここでの目標は、心血管疾患における嚥下障害のメカニズムを調査するためのプロトコルの概要を説明することです。本稿では、マウスの糞便を無菌的に採取・移植し、腸管を分離し、「スイスロール」法を用いて消化管の変化を調べる免疫染色法について論じる。

要約

腸内細菌叢の嚥下障害は、心血管および代謝障害の病態生理学において役割を果たしていますが、そのメカニズムはよく理解されていません。糞便微生物叢移植(FMT)は、疾患の病態生理学における微生物叢または単離種全体の直接的な役割を描写するための貴重なアプローチです。再発性 クロストリジウム・ディフィシル 感染症の患者にとって安全な治療選択肢です。前臨床試験では、腸内細菌叢を操作することが、嚥下障害と疾患の間の機構的関連を研究するための有用なツールであることが示されています。糞便微生物叢移植は、心代謝疾患の管理と治療のための新しい腸内細菌叢標的治療法の解明に役立つ可能性があります。げっ歯類での高い成功率にもかかわらず、移植に関連する翻訳変化が残っています。ここでの目標は、実験的な心血管疾患における腸内細菌叢の影響を研究する際のガイダンスを提供することです。この研究では、マウス研究における糞便微生物叢の収集、取り扱い、処理、および移植のための詳細なプロトコルについて説明します。収集と処理の手順は、ヒトとげっ歯類の両方のドナーについて説明されています。最後に、スイスローリング技術と免疫染色技術を組み合わせて使用して、心血管疾患および関連する腸内細菌叢メカニズムにおける腸特異的な形態と完全性の変化を評価する方法について説明します。

概要

心臓病や脳卒中などの心血管代謝障害は、世界の主要な死因です¹。身体的不活動、栄養不良、加齢、および遺伝学は、これらの障害の病態生理学を調節します。証拠の蓄積は、腸内細菌叢が2型糖尿病²、肥満³、高血圧⁴などの心血管障害および代謝障害に影響を与えるという概念を支持しており、これらの疾患に対する新しい治療アプローチの開発の鍵を握る可能性があります。

微生物叢が病気を引き起こす正確なメカニズムはまだ不明であり、現在の研究は方法論の違いもあって非常に多様です。糞便微生物叢移植(FMT)は、疾患の病態生理学における微生物叢または単離種全体の直接的な役割を描写するための貴重なアプローチです。FMTは、表現型を誘導または抑制するために動物実験で広く使用されています。例えば、カロリー摂取量およびグルコース代謝は、糞便物質を病気のドナーから健康なレシピエントに移すことによって調節することができる^5,6。ヒトでは、FMTは再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の患者にとって安全な治療選択肢であることが示されています⁷。心血管疾患管理におけるその使用を裏付ける証拠が浮上しています。たとえば、痩せ症候群患者からメタボリックシンドローム患者へのFMTは、インスリン感受性を改善します⁸。腸内細菌叢症は、ヒトとげっ歯類の両方の研究で高血圧にも関連しています9,10,11。無菌マウスに高塩食を与えられたマウスからのFMTは、レシピエントを炎症および高血圧にかかりやすくする¹²。

げっ歯類におけるFMTの成功率が高いにもかかわらず、翻訳上の課題は残っています。肥満およびメタボリックシンドロームを治療するためにFMTを使用する臨床試験は、これらの障害に対する影響が最小限またはまったくないことを示しています¹³、^14、15。したがって、心代謝障害の治療のために腸内細菌叢を標的とする追加の治療手段を特定するには、より多くの研究が必要です。腸内細菌叢と心血管疾患に関する入手可能な証拠のほとんどは連想的です。記載されたプロトコルは、FMTとスイスローリング技術の組み合わせを利用して、疾患と腸内細菌叢との関連の両方を示し、腸腸のすべての部分の完全性を直接評価する方法について説明しています¹⁶、^17、18。

この方法の全体的な目標は、実験的心血管疾患における腸内細菌叢の影響を研究するためのガイダンスを提供することです。このプロトコルは、生理学的翻訳を促進し、所見の厳密さと再現性を高めるために、実験デザインにおけるより詳細と重要な考慮事項を提供します。

プロトコル

ヴァンダービルト大学の施設動物管理および使用委員会は、この原稿に記載されているすべての手順を承認しました。ジャクソン研究所から購入した生後3か月のC57B1 / 6雄マウスを、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って飼育および世話をしました。

1. ヒト糞便検体の採取・保管・加工

1. 被験者が診療所にいる場合は、滅菌容器を使用して便サンプルを収集します。糞便サンプルを、収集から36時間以内に4°Cで処理の準備ができるまで冷蔵します。あるいは、市販のツールを使用して便サンプルを収集し、特に家庭での使用のために、周囲温度で簡単かつ拡張されたDNA安定性を実現します。
2. バイオセーフティレベルのドラフトを10%漂白剤溶液またはその他の環境保護庁が承認した消毒剤で消毒します。
3. スツールを冷蔵倉庫から取り出し、ドラフトに持ち込みます。使い捨てヘラを使用して~1 gのアリコートを作り、完全に処理できるようになるまで-80°Cの冷凍庫に保管します。
4. すべての使い捨てアイテムはバイオハザードゴミ箱に捨ててください。フードおよびプロセッサーが接触するすべての表面と、フードから取り外すアイテムを消毒します。

2. マウス糞便サンプルの無菌採取

注意: 滅菌器具を含む無菌技術を使用してください。

1. CO2窒息によりマウスを安楽死させる。マウスの胸部と側面に70%エタノールをスプレーし、皮膚と腹腔を慎重に開いて胃腸管を露出させます。
2. 盲腸を分離し、滅菌外科用ハサミを使用して半分に切ります。簡単に言えば、盲腸を露出させ、回腸から近位に0.5 cm、結腸との接合部で遠位に0.5 cm切断します。分離した盲腸を滅菌ペトリ皿に移します。
3. 滅菌ヘラを使用して盲腸内容物を滅菌チューブに移し、アリコートを-80°Cの冷凍庫に保管します¹⁹。
   注:腸内の細菌の大部分は嫌気性菌であるため、酸素にさらされると、室内の雰囲気での隔離手順中に生物が損傷または死亡する可能性があります。したがって、糞便サンプルは、細菌の生存能力を維持するために嫌気性チャンバーで分離する必要があります。

3.糞便移植

1. 新鮮なまたは以前に凍結した糞便ペレットを滅菌生理食塩水に1:20(w:v)の割合で再懸濁し、均質になるまでボルテックスします。
2. ホモジネートを30 μmの細孔ナイロンフィルターに通して、大きな粒子状物質を除去します。79 × g で5分間遠心分離し、移植に使用する上清を回収します。
3. 無菌レシピエントマウスあたりスラリー100μLを3日間連続して経口強制投与し、続いて3日毎に2週間経管投与した。レシピエント自身の風土病微生物叢を排除するために最初に抗生物質で治療された場合、従来のマウスを使用して腸内細菌叢のメカニズムを研究します。例えば、セフトリアキソン(400 mg / kg)をレシピエントマウスに5日間連続して経口投与し、糞便スラリーを経管投与する前に投与します。
   注:研究によると、血圧を含む心血管の変化を引き出すには、この治療の最低2週間が必要であることが示唆されています²⁰。
4. 無菌レシピエントマウスがグノトバイオティクスフィルムアイソレーターに単一収容され、滅菌された食物と水が与えられることを確認してください。

4.収縮期血圧測定

注:従来飼育されていた3ヶ月齢のC57Bl/6マウスからFMTを受けたノトバイオティクスマウスに浸透圧ミニポンプ(Alzet、モデル2002)を移植し、低用量アンジオテンシンII(140 ng/kg/min)を2週間注入した。血圧はテールカフ を介して 毎週監視されました。浸透圧ミニポンプを埋め込むためのプロトコルは以前に報告されています²¹。テールカフは、以下に簡単に要約するように実行しました。テールカフなどの血圧を測定する非侵襲的方法は、グノトバイオティクスマウスのFMT研究に適しています。テールカフを実行する方法の詳細な手順は、以前に説明されています²²。

1. 簡単に言うと、ノトバイオティクスアイソレーターからマウスを取り出し、テールカフマシンプラットフォームとマウスホルダーを予熱します。
2. 意識のあるマウスを加熱されたプラットフォーム上の拘束下に置き、テールカフプレチスモグラフィーを使用して少なくとも3ラウンドの収縮期血圧測定値を収集します。以下のステップを、適切な測定日の3日前の連続した日に行い、ストレスを軽減するために拘束されるようにマウスを訓練する。
   1. マウスを予熱したホルダーにそっと置き、尾を外側に残します。マウスにストレスを与えないように、上部をつままずかずに慎重にテープで留めます。
   2. マウスをホルダーに入れます。順応するためにシートで覆われた3〜5分間プラットフォーム上に置きます。
3. 各動物の平均収縮期血圧について、すべてのラウンドからの測定値を平均します。

5.心血管系の変化に対するFMTの評価

1. 血圧測定に続いて、マウスを安楽死させ、セクション2で説明するように、盲腸内容物を無菌的に収集します。
2. 心臓、大動脈、肝臓、腸間膜動脈、腎臓などの腸やその他の組織を採取して、心臓代謝の健康における腸内細菌叢の役割を調べます。組織を採取するには、マウス内の組織を見つけ、ハサミを使用してそれらを切除します。
3. ドナーマウスとレシピエントマウスから収集された糞便サンプル/盲腸内容物に対してメタゲノムシーケンシング分析を実行して、FMT²³後の腸内細菌叢の生着を確認します。微生物叢のコロニー形成が成功した最初の証拠は、ドナーとレシピエントの微生物叢が類似していることを確認することです。
4. 採取した腸組織に対してスイスロール法(セクション6を参照)を使用し、免疫染色および組織学と組み合わせて、形態学的および細胞発現の変化を調べます²⁴。

6.腸腸スイスロールを作る

1. 1日目
   1. 70%エタノールを噴霧した適切に安楽死させたマウスで、マウス腸を肛門側(後腹膜に固定)から胃側に解剖する。分離した胃腸管全体を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むペトリ皿に入れます。近位端を胃の端からそっと持ち、周囲の脂肪と結合組織を手で取り除きます。
   2. 小腸(虫垂から頭)を分離し、各長さでZ型ジグザグを作ります。その後、切断して、十二指腸、空腸、回腸を連続して、前述の^ように25を得る。盲腸の下の腸の部分を切断することによって結腸を隔離します。
   3. 十二指腸、空腸、回腸、結腸を切断します。
   4. 腸を引き裂かないように、注射器とボール先端の針でPBSを使用して腸の内側を洗い流して洗浄します。
   5. 腸をろ紙の上に置きます。紙にセクションの名前(十二指腸など)をラベル付けし、近位の場合は右上隅に「P」、右下隅の遠位の場合は「D」にラベルを付けます。
   6. ボールチップハサミで腸を縦に切ります。ろ紙の腸を開きます。必要に応じて、さらにPBSで洗浄します。
   7. 2つのろ紙の間に腸を挟みます。腸の近くの4つのポイント/コーナーでろ紙をホチキス止めします。
   8. 10%ホルマリン中性緩衝液(リン酸ナトリウム4.0g、一塩基性、リン酸ナトリウム6.5g、二塩基性、37%ホルムアルデヒド100mL、蒸留水900mL)に浸す。プラットフォームロッカーを使用して、室温で5rpmで一晩振とうします。
2. 2日目
   1. 蒸留水中で2%アガロースを調製し、アルミホイルで覆われたビーカー中で攪拌子で加熱する。
   2. 組織を回収します。上部のろ紙をはがします。近位側が最初に内側に入るように近位側から腸を転がし、スライド上で内腔も内側になるように内側に転がします。必要に応じて、30 Gの針または2本で固定します。
   3. 使い捨てグラデュエートトランスファーピペットを使用して1 mLのアガロースを吸引し、組織内の気泡を避けながら、平らな面の転がされた腸切片にアガロースを注ぎます。
   4. アガロースを冷まして固化させます。かみそりの刃を使用して、組織切片の周りの余分なアガロースをトリミングします。
   5. 腸切片を組織処理/埋め込みカセットに入れます(アガロースによる高さの増加に対応するために、通常のカセットよりも大きい)。4°Cで70%エタノールに浸します。
   6. パラフィン包埋組織スライドを準備し、以下に概説するように免疫染色に進みます。

7.腸管の免疫染色

1. 脱パラフィン
   1. ラックにスライドを入れた次の浴槽を通過します:キシレンを3分間、新鮮なキシレンを再び3分間、キシレンを100%エタノール(1:1)で3分間、95%エタノールで3分間、70%エタノールで3分間、50%エタノールで3分間。
   2. 冷たい水道水でやさしくすすいでください。水道水の入ったお風呂に保管してください。
2. 抗原賦活化
   1. 脱パラフィン後、抗原賦活化バッファー(pH 6の0.01Mクエン酸三ナトリウム二水和物および0.05%Tween-20)の浴中のラックでスライドを100°Cで20分間煮沸します。
   2. 冷たい水道水の下で実行します。
3. 染色
   1. スライドを浴槽から取り出し、ティッシュの表面を上にしてスライドボックスに入れ、底に濡れた実験用ワイプ/ペーパータオルを入れます。疎水性マーカーペンで組織の周りに輪郭を描きます。
   2. トリス緩衝生理食塩水(TBS)+ 0.025%Triton X-100を組織に滴下し、5分間インキュベートします。この手順を繰り返します。
   3. TBS + 10%ウシ胎児血清(FBS)+ 1%ウシ血清アルブミン(BSA)で室温で2時間ブロックします。スライドを横向きにして、実験室用ワイプのブロッキングバッファーを取り外します。
   4. 一次抗体溶液を加え、4°Cで少なくとも2時間または一晩インキュベートします。TBS + 0.025% Triton X-100 で、切片上で ~200 μL を静かにピペッティングして、穏やかに洗浄します。
   5. 二次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。手順3のように、ピペットですすぎ、TBSでスライドを5 x 7.3.4分間すすぎます。
   6. 封入媒体とカバーガラスで取り付けます。

結果

上記の手順を 図 1 にまとめます。マウス盲腸内容物またはヒト糞便を滅菌生理食塩水に再懸濁してスラリーを調製し、無菌マウス(100μL)に経管栄養により、まず3日間連続して、次いで3日に1回ずつ与えます。プロトコルの最後に、血圧をテールカフ法で測定し、マウスを安楽死させ、腸内細菌叢の変化と心血管および代謝の変化を評価するために組織を採取します。

...

ディスカッション

心血管疾患および代謝性疾患における腸内細菌叢の因果的役割を研究するための貴重なアプローチは、全微生物叢または選択した関心のある種を無菌マウスに移すことです。ここでは、高血圧性疾患における腸内細菌叢の役割を研究するために、ヒトおよび従来飼育マウスから無菌マウスに糞便サンプルを収集するプロトコルについて説明します。

マウスでは、無菌的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost	ThermoFisher	B40932
Anaerobic chamber	COY	7150220
Apolipoprotein AI	Novus Biologicals	NBP2-52979
Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Bleach solution	Fisher Scientific	14-412-53
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	B14
CD3 antibody	ThermoFisher	14-0032-82
CD68 monoclonal antibody	ThermoFisher	14-0681-82
Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-221
CODA high throughput monitor	Kent Scientic Corporation	CODA-HT8
Cryogenic vials	Fisher Scientific	10-500-26
Disposable graduate transfer pipettes	Fisher Scientific	137119AM
Disposable syringes	Fisher Scientific	14-823-2A
Ethanol	Fisher Scientific	AA33361M1
Feeding Needle	Fine Science Tools	18061-38
Filter (30 µm)	Fisher Scientific	NC0922459
Filter paper sheet	Fisher Scientific	09-802
Formalin (10%)	Fisher Scientific	23-730-581
High salt diet	Teklad	TD.03142
OMNIgene.GUT	DNAgenotek	OM-200+ACP102
Osmotic mini-pumps	Alzet	MODEL 2002
PAP Pen	Millipore Sigma	Z377821-1EA
Petri dish	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	21-236-18C
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100
Serile Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Smart spatula	Fisher Scientific	NC0133733
Stool collection device	Fisher Scientific	50-203-7255
TBS Buffer	Fisher Scientific	R017R.0000
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Varimix platform rocker	Fisher Scientific	09047113Q
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-41
Xylene	Fisher Scientific	1330-20-7, 100-41-4