小鼠睾丸切除术和卵巢切除术减少性激素的产生

摘要

这份手稿描述了一种快速进行存活啮齿动物睾丸切除术和卵巢切除术的一致方法。

摘要

性激素信号转导在多个器官系统以及各种疾病（包括神经退行性疾病）的进展中起着关键作用。在小鼠模型系统中操纵性激素水平可以研究它们对器官/组织和疾病进展的影响。睾丸切除术 - 睾丸切除术 - 卵巢切除术 - 卵巢切除术 - 提供了一种消耗内源性激素的方法，以便可以通过药物或其他递送方法提供精确的激素水平。在这里，我们为小鼠模型系统中的睾丸切除术和卵巢切除术提供了快速和微创的方法，以减少性激素。该方案详细介绍了手术准备和通过阴囊切除睾丸，以及通过左右背侧的两个切口切除卵巢。

引言

睾丸和卵巢是负责产生性激素的主要器官。导致睾酮和雌激素产生的荷尔蒙通讯级联是一个特征明确的过程，始于下丘脑，释放促性腺激素释放激素 （GnRH）¹。GnRH的释放导致垂体释放黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。当这些激素进入血液时，它们会影响身体的其他组织。LH 的主要目标是睾丸（男性）和卵巢（女性）²。作为对LH的反应，睾丸产生并释放睾酮³。同样，卵巢产生雌激素⁴。虽然这些激素的预期效果是使细胞和身体为受精做好准备并确保生殖系统正常运作，但许多其他身体系统也会受到影响。

性激素与多种生理功能有关。例如，雌激素通过防止破骨细胞吸收骨骼来帮助维持骨稳态。因此，卵巢切除小鼠模型可用于研究骨质疏松症等骨骼疾病的生理学^5,6,7。睾酮和雌激素也是许多心血管和神经退行性疾病的研究靶点。最近，睾丸激素分泌升高加上高脂肪饮食与血管氧化应激有关⁸。在大脑中，卵巢切除术后 LH 的变化导致了空间记忆的改变⁹。卵巢切除术后雌激素的减少也已成为研究海马细胞死亡的模型系统，因为这会诱导细胞凋亡，导致记忆缺陷¹⁰。睾酮在肾移植后的小鼠模型和人类肾脏生长中也显示出作用¹¹。

激素剥夺小鼠模型的创建允许研究性激素及其激素级联对各种疾病或组织的影响。这可以通过手术切除睾丸（睾丸切除术）或卵巢（卵巢切除术）来实现。该过程可以在任何品系的小鼠中进行，当它们与断奶年龄（二十一天）或任何成年年龄一样小。卵巢切除术在雌性小鼠中进行，而睾丸切除术在雄性小鼠中进行。通过去除这些器官，雌激素和睾丸激素及其许多衍生物（如黄体酮）的水平可以大大降低^12,13。通过适当的技术，在小鼠中进行睾丸切除术或卵巢切除术的过程可以是快速且微创的。以安全有效的方式快速切除这些器官可以实现快速的手术处理，同时在正确执行时具有 100% 的存活率，从而将小鼠数量保持在最低限度。在这里，我们详细介绍了快速切除睾丸和卵巢的方案，并展示了适当的术后监测，使研究人员能够快速安全地进行这种手术。我们还包括性器官和周围组织的视觉示例，以便在执行此手术时为外科医生提供解剖标志。

研究方案

所有动物实验均由UTSW机构动物护理和使用委员会批准（APN#2019-102840）。

1. 鼠睾丸切除术

1. 准备无菌工作区域，并确保必要的手术器械已经过消毒并随时可用。遵循啮齿动物生存手术的无菌实践。
2. 记录雄性小鼠的体重，并根据机构指南施用首选的麻醉方法。在该方案中，通过精密汽化器输送 2% 异氟醚以维持麻醉。手术前，根据机构指南服用止痛药。在该方案中，皮下注射1.0mg / kg丁丙诺啡SR和5mg / kg美洛昔康。
3. 一旦小鼠处于麻醉状态，用润滑的眼部凝胶覆盖动物的眼睛，以避免形成眼睛受伤、角膜干燥或溃疡。
4. 在继续之前，通过进行脚趾捏合反应测试来确保适当的麻醉平面。
5. 在将动物放在无菌、悬垂的手术区域之前，先准备好动物的手术区域。
   1. 接下来，使用一把剪刀剃掉鼠标的腹股沟和阴囊区域。
      注意:剃除阴茎上方的下腹部将在手术过程中获得更好的可视化效果。
   2. 使用棉布涂抹器，在动物的皮肤上涂上一层薄薄的脱毛膏（见 材料表），覆盖阴囊和刚刚剃光的周围区域。等待 30 秒，然后用一块干净的纱布去除奶油。
   3. 使用 70% 乙醇浸泡的纱布海绵擦去该区域残留的乳霜和头发。
      注意:此步骤中的70%乙醇有助于完全去除脱毛膏。手术部位的防腐准备在步骤1.8中进行。
6. 将鼠标转移到手术区域，并确保在手术过程中有热源来维持动物的体温。将动物仰卧放在手术单上，并使用柔软的胶带将小鼠的脚粘在手术垫上。
7. 如果睾丸上升到腹部，小心触诊腹部，使睾丸下降。用戴手套的手在腹部向下施加轻轻的滚动压力。
   注意:在解剖镜下或使用一对放大镜进行这种手术更容易，以增强放大倍率。如果在解剖镜下执行此操作，请花点时间将鼠标的阴囊置于镜的视野下方。可以使用软胶带将鼠标的腿或腹部粘在手术区域上，以确保其保持在正确的位置。
8. 用Betadine外科磨砂膏（或类似的抗菌皮肤制剂磨砂膏）擦洗皮肤，然后用70%酒精磨砂膏至少擦洗三次，以确保适当的皮肤消毒。对于每次擦洗，以径向向外的动作擦洗，因此首先擦洗切口部位的中间，最后擦洗剃光手术区域的外缘。
9. 此时，戴上无菌外科手套。对于该过程的后续步骤，请使用无菌技术。用无菌手术单覆盖小鼠，在动物上开一个小切口（切成约0.5-1英寸见方以适合手术部位），以覆盖身体。
10. 按照您批准的机构动物福利指南，使用手术刀刀片或类似器械在阴囊中创建一个长度约为 1 厘米 -1.5 厘米的腹侧中线切口。
11. 抓住皮肤的切割边界，使用钝头器械将皮肤与下面的组织分开。花点时间在切口的外侧、上缘和下缘上做这个。
12. 使用刮刀和镊子将皮肤上的切口移动到其中一个睾丸顶部的中心，从而隔离睾丸。如果这很困难，请回到 1.11 并进一步将皮肤与底层分开。
13. 取一把弯曲的镊子，将它们放在睾丸的两侧。轻轻向下按压睾丸外。用镊子抓住睾丸顶部的薄而透明的肌肉层。这是cremaster肌肉。通过观察该层及其循环，独立于其下方的睾丸移动，可以验证正确的肌肉层。
    注意:正确组织的识别通过其透明度和独立于下层组织移动的能力来确认。
    1. 使用镊子操纵肌肉组织，直到抓住肌肉的顶点。这应该是最低的部分，睾丸和附睾尾部位于下方。
14. 用镊子抓住提骨肌，轻轻地远离睾丸和附睾。使用一把小的 Vannas 弹簧剪刀在第一睾丸顶端的提睾肌上切开一个 0.5 厘米的切口。
15. 放置一个锁定夹amp 在切割的 cremaster 肌肉的后边缘。使用一对狭窄的止血剂或一对锁定的微型针架。夹紧组织后，轻轻地将仪器放在鼠标的侧面，以在以下程序步骤中保持组织夹紧。
16. 使用镊子抓住步骤 1.14 中切口的上缘。当提睾肌的两端缩回时，使用另一把镊子伸入腔内并轻轻抓住睾丸。
    1. 通过肌肉上的孔向外拉。注意手术区域是否有任何血管和血液切口的迹象。
    2. 睾丸、附睾、附着的精索和血管在组织适当外化时会很明显。
    3. 在附睾和睾丸的尾背端附近，睾丸与提睾肌有一个纤维状附着点。横向滚动外部组织以找到该插入点。切断它以避免对肌肉的损伤，并允许组织进一步隔离和可视化。使用两对镊子进行夹紧和撕裂技术。
17. 从腹股沟脂肪垫寻找睾丸周围的脂肪组织。用一把镊子抓住脂肪垫，轻轻拉动使其外部。
    1. 不要抓住沿着脂肪垫行进的血管，因为拉扯它会导致出血。
18. 找到精索、血管和靠近外部组织的剩余脂肪垫，并使用一对止血剂将其夹住。在睾丸远端保持轻微张力的同时，烧灼止血钳夹远端的精索和血管。
    1. 完成后，慢慢松开烧灼端近端的夹具，并检查是否有出血迹象。如果存在，请重复此步骤。使用一把镊子在被烧灼组织的远端保持温和的张力是有帮助的。
19. 让精索切断的残端缩回体内。抓住 cremaster 肌肉的两个切割端并将它们放在一起。评估组织中切口的大小，并使用 4-0 或 5-0 可吸收缝合线闭合组织。根据切口大小，需要 1 或 2 条缝合线。使用缝合剪刀将缝合线末端修剪至 0.5 厘米。
20. 在阴囊的另一侧重复步骤1.13-1.20，切除第二个睾丸。
21. 准备闭合皮肤切口。
    1. 确保两个组织残端的良好止血。止血不良会导致手术区域残留出血。如果发生这种情况，请定位出血部位并烧灼。这是通过用钝器缓慢而小心地操纵组织来避免的。
    2. 如果在手术区域看到血液，请使用消毒的棉签涂抹器擦干该区域，以便更好地观察。使用注射器将生理盐水滴到该区域，以冲洗手术区域以外的任何血液或液体。
22. 将皮肤切口的两侧拉在一起，为闭合做好准备。确保 cremaster 切口的缝合端没有突出到皮肤切口中。如果需要，进一步修剪缝合线的末端。
23. 闭合皮肤。
    1. 如果使用伤口夹，请使用镊子剥离皮肤并将其从下面的组织拉开。将一个伤口夹放在切口的中心。检查皮肤是否剪好。如果切口稍大，一个伤口夹无法充分闭合，则可以在切口的上部和下部涂抹手术皮肤胶。
    2. 如果使用缝合线，请将所需数量的缝合线穿过皮肤，不要抓住下面的组织。这种类型的切口需要使用 2-0 不可吸收的缝合材料进行 3-0 次单间断缝合。
24. 用生理盐水和消毒棉签轻轻清洁手术部位周围的皮肤，以去除任何干血或残留的消毒磨砂膏。

2. 鼠卵巢切除术

1. 准备无菌工作区域，并确保必要的手术器械已经过消毒并随时可用。遵循啮齿动物生存手术的无菌实践。
2. 记录雌性小鼠的体重，并根据您的机构指南使用首选的麻醉方法。在该方案中，通过精密汽化器输送 2% 异氟醚以维持麻醉。在手术前，请根据您的机构指南服用止痛药。在该方案中，皮下注射1.0mg / kg丁丙诺啡SR和5mg / kg美洛昔康。
3. 在动物的眼睛上涂抹润滑眼凝胶，以避免形成眼睛损伤、角膜干燥或溃疡。确保在操作过程中有热源来维持动物的体温。通过检查脚趾捏合反应来确保适当的麻醉平面。
4. 在将动物放入手术区域之前，请准备好动物的手术区域。
   1. 用一把剪子轻轻剃掉动物背部背外侧区域的毛发。从臀部上缘上方和肋骨下缘下方的区域以及这些标志之间的区域去除毛发。
   2. 使用棉签涂抹器，在动物的皮肤上涂上一层脱毛膏，覆盖刚刚剃须的区域。等待 30 秒，然后用一块纱布去除乳霜，去除残留的细毛。
   3. 使用 70% 乙醇浸泡的纱布海绵擦拭手术区域残留的乳霜和头发。
      注意:此步骤中的70%乙醇有助于完全去除脱毛膏。手术部位的防腐准备在步骤2.5中进行。
5. 将动物置于手术区域的侧卧位（用于一次切开一个卵巢），并确保有热源可用。用 Betadine 外科磨砂膏（或类似的抗菌皮肤制剂磨砂膏）擦洗手术区域，然后用 70% 酒精至少擦洗 3 次，以确保适当的皮肤消毒。对于每次擦洗，以径向向外的擦洗方式擦洗，因此首先擦洗切口的中间，最后擦洗剃光手术区域的外缘。
6. 此时，戴上无菌外科手套。对于该过程的后续步骤，请使用无菌技术。将带有小切口的手术单放在动物身上（在手术单上切出大约 0.5-1 英寸的正方形以适合手术部位），使身体被覆盖在手术材料中。
7. 通过找到小鼠臀部和肋骨之间的中间点来定位手术切口的理想位置（见 图2）。用镊子抓住皮肤，并在该位置的皮肤上切开1.0厘米的切口。
8. 使用钝头器械（探头、手术刮刀或钝头止血剂）将皮肤与肌肉组织下方分离。花点时间在切口的外侧、上缘和下缘上做这个。
9. 找到腹部的背外侧肌壁。如果需要，去除位于皮肤和肌肉层之间的脂肪组织。在成熟小鼠中，这种脂肪组织更为突出。将这个脂肪组织移向小鼠的尾端，露出肌肉壁。
   1. 脂肪组织与腹壁的区别在于颜色:脂肪组织呈淡白色，位于较浅层，而腹壁呈粉红色，比脂肪组织更深。
10. 用大鼠牙镊子抓住腹壁，并在其中切开0.5厘米的切口。
11. 用一把镊子抓住这个切口的一个边缘，用第二对镊子到达体腔内部，找到卵巢、子宫角和脂肪垫。轻轻地将其拉过肌肉壁的切口，将肌肉与下层组织分离并使其外部化。找到子宫角和卵巢之间的过渡。
12. 通过执行挤压和撕裂技术切断卵巢。
    1. 将一个夹子放在子宫角的远端，将第二个夹子放在第一个夹子的远端。在用两个夹子施加用力压的同时，将较远的夹子从身体上移开，撕裂它们之间的连接。为尽量减少出血和组织损伤，请在此过程中保持近端夹具静止不动，并注意不要将其从身体上拉开。
    2. 或者，使用烧灼术。使用一把镊子或止血剂将子宫角夹在所需烧灼点的近端。使用烧灼工具切断组织。
13. 轻轻缓慢地松开近端夹并检查是否有出血迹象。
14. 让组织残端退缩到体腔中。抓住腹壁，轻轻向上拉。不要用力将组织残端向内，因为这会增加出血的可能性。
15. 将切口的边缘定位到肌肉壁上，并将它们放在一起，准备缝合。
16. 使用 4-0 可吸收缝合材料将 1-2 条单间断缝合线放入腹肌壁。使用缝合剪刀将缝合线末端修剪至 0.5 厘米。
17. 闭合切口，让皮肤恢复到自然静止状态，然后向上切开，注意不要抓住下面的组织或缝合材料的末端。将 1-2 个伤口夹放在变形的皮肤上。根据您的机构指南，也可以使用 4-0 不可吸收的缝合材料闭合皮肤。
18. 要移除另一个卵巢，请切换鼠标的位置，使另一侧朝上。切换鼠标位置时要轻柔，以免对步骤 2.17 中伤口夹住的皮肤施加太大压力。
19. 在此一侧，重复步骤 2.5 - 2.17。
20. 用生理盐水和消毒棉签轻轻清洁手术部位周围的皮肤，以去除任何干血或残留的消毒磨砂膏。

3. 术后护理

1. 根据您的机构指南，在术后最多 72 小时内服用止痛药。记录动物的外科手术过程，注明使用的日期、时间、麻醉剂和镇痛剂。在这里，丁丙诺啡缓释剂和美洛昔康在术前给药。
2. 动物手术完成后，将它们转移到一个干净的笼子里，里面铺着干纸巾。将此笼子 2/3 放在热源上，让笼子的其他 1/3 停止加热。在小鼠从麻醉中恢复之前，不要将小鼠放在笼子里。
3. 让动物重新获得在笼子里自由走动的能力，然后再将它们放回带有正常动物垫料的干净笼子里。此时，如果小鼠都已从麻醉中恢复，则可以将它们安置在一起。
4. 在手术后的头几天，确保容易获得潮湿的食物和水。将一些湿润的食物放在笼子的底部。经常检查小鼠手术部位，寻找任何感染或出血的迹象。
5. 手术后，确保小鼠单独饲养或与同时接受相同手术的其他动物一起饲养。从手术中恢复的小鼠与未手术的小鼠位于同一笼子中，可能会带来危险，应避免。
6. 对于接受过卵巢切除术并在背部背外侧有伤口夹的小鼠，从笼子中移除任何啮齿动物冰屋栖息地，以减少小鼠伤口夹在愈合的第一周被冰屋夹住的机会。
7. 在愈合时间的前 72 小时内，每 12 小时监测动物是否有感染、疼痛或手术并发症的迹象。
8. 手术后 10-14 天使用伤口夹去除工具去除伤口夹。

结果

这里介绍的程序是在C57BL / 6J背景中的一至三个月大的小鼠中进行的。雄性小鼠在手术时体重为16-28克，雌性小鼠体重为14-24克。该程序已经过优化，适用于从断奶到成年的许多年龄的小鼠。

手术睾丸切除术涉及腹侧阴囊中的单个皮肤切口，如图 1A 所示。两个睾丸一次切除一个，并通过输精管和精索血管切断，导致睾丸和附睾的切除（图1B...

讨论

手术切除睾丸和卵巢允许在受控激素剥夺下研究小鼠生理学。该技术对许多科学领域都很重要，包括神经退行性疾病、矿物质代谢、心血管和生殖健康 15,16,17,18,19,20,21。在这里，我们详细介绍了使用生存手术快速、安全、?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Syringe	BD	309659
30G 1/2" Needle	BD	305106
AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Betadine Solution	Fisher Scientific	NC0158124
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	10-000-692
Double -ended Micro Spatula	Fine Science Tools	10091-12
Galilean Loupes	Fine Science Tools	28050-30	Optional, can provide better clarity during procedure
Gauze Sponges, 4"x4"	Fisher Scientific	13-761-52
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
High Temp Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Using the fine tip attachment
Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13
PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN	Covetrus	29242	4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best
Rodent Warming pad	Kent Scientific	RT-0515
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Straight Locking Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Surgical Scissors	Fine Science Tools	140-60-09
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream	Amazon	N/A
Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue	Amazon	#9861-900