Orquiectomia murina e ooforectomia para reduzir a produção de hormônios sexuais

Resumo

Este manuscrito descreve uma maneira consistente de realizar rapidamente orquiectomias e ovariectomias de roedores de sobrevivência.

Resumo

A sinalização de hormônios sexuais desempenha um papel crítico em vários sistemas de órgãos, bem como na progressão de várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas. A manipulação dos níveis de hormônios sexuais no sistema modelo murino permite o estudo de seu impacto em órgãos/tecidos e na progressão da doença. Orquiectomia - a remoção cirúrgica dos testículos - e ovariectomia - a remoção cirúrgica dos ovários - fornecem um método para esgotar os hormônios sexuais endógenos para que os níveis hormonais precisos possam ser fornecidos através de drogas ou outros métodos de entrega. Aqui, fornecemos métodos rápidos e minimamente invasivos para orquiectomia e ooforectomia no sistema modelo murino para a redução de hormônios sexuais. Este protocolo detalha o preparo cirúrgico e a excisão dos testículos através do saco escrotal, e a excisão dos ovários através de duas incisões no dorso lateral direito e esquerdo.

Introdução

Os testículos e ovários são os principais órgãos responsáveis pela produção de hormônios sexuais. A cascata de comunicação hormonal que leva à produção de testosterona e estrógeno é um processo bem caracterizado que se inicia no hipotálamo com a liberação do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH)¹. A liberação de GnRH causa a liberação de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-estimulante (FSH) da glândula pituitária. Como esses hormônios entram na corrente sanguínea, eles então afetam outros tecidos do corpo. O alvo primário do LH são os testículos (no sexo masculino) e os ovários (no sexo feminino)². Em resposta ao LH, os testículos produzem e liberam testosterona³. Da mesma forma, os ovários produzem estrogênio⁴. Enquanto os efeitos pretendidos desses hormônios são preparar as células e o corpo para a fertilização e garantir um sistema reprodutivo funcional, muitos outros sistemas corporais podem ser afetados.

Os hormônios sexuais têm sido associados a diversas funções fisiológicas. Por exemplo, o estrogênio ajuda a manter a homeostase óssea, impedindo a reabsorção óssea pelos osteoclastos. Por essa razão, modelos de camundongos ovariectomizados podem ser utilizados para estudar a fisiologia de doenças ósseas como a osteoporose ^5,6,7. Testosterona e estrogênio também são alvos de pesquisa para muitas doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Recentemente, a produção elevada de testosterona aliada à dieta rica em gordura tem sido associada ao estresse oxidativo vascular⁸. No cérebro, alterações no LH após ooforectomia têm causado alterações na memória espacial⁹. A redução de estrógenos após ooforectomia também se tornou um sistema modelo para estudar a morte celular no hipocampo, pois pode induzir apoptose, resultando em déficits de memória¹⁰. A testosterona também tem demonstrado um papel no crescimento dos rins tanto em modelos de camundongos quanto em humanos após transplante renal¹¹.

A criação de um modelo murino privado de hormônios permite o estudo de hormônios sexuais e suas cascatas hormonais em várias doenças ou tecidos. Isso pode ser realizado pela remoção cirúrgica dos testículos (orquiectomia) ou ovários (ooforectomia). Este procedimento pode ser realizado em camundongos de qualquer linhagem quando eles são tão jovens quanto a idade de desmame (vinte e um dias) ou qualquer idade adulta. A ooforectomia é realizada em camundongos fêmeas, enquanto a orquiectomia é realizada em camundongos machos. Com a remoção desses órgãos, os níveis de estrogênio e testosterona e muitos de seus derivados, como a progesterona, podem ser bastante reduzidos^12,13. O processo de realização de orquiectomias ou ovariectomias em camundongos pode ser rápido e minimamente invasivo com a técnica adequada. A rápida excisão desses órgãos de forma segura e eficiente pode permitir um processamento cirúrgico rápido, mantendo o número mínimo de camundongos por ter uma taxa de sobrevivência de 100% quando realizada corretamente. Aqui, detalhamos um protocolo para a excisão rápida dos testículos e ovários e demonstramos o acompanhamento pós-cirúrgico adequado para permitir que os pesquisadores realizem essa cirurgia de forma rápida e segura. Também incluímos exemplos visuais dos órgãos sexuais e tecidos circundantes para fornecer ao cirurgião pontos de referência anatômicos ao realizar este procedimento.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UTSW (APN#2019-102840).

1. Orquiectomia murina

1. Prepare um campo de trabalho asséptico e certifique-se de que os instrumentos cirúrgicos necessários foram esterilizados e estão prontamente disponíveis. Siga práticas assépticas para cirurgia de sobrevivência de roedores.
2. Registrar o peso do camundongo macho e administrar o método de anestesia preferido de acordo com as diretrizes institucionais. Nesse protocolo, isoflurano a 2% foi administrado por vaporizador de precisão para manutenção da anestesia. Antes do procedimento, administrar medicamentos para dor de acordo com as diretrizes institucionais. Nesse protocolo, 1,0 mg/kg de Buprenorfina SR e 5 mg/kg de Meloxicam foram administrados por via subcutânea.
3. Quando o rato estiver sob anestesia, cubra os olhos do animal com gel lubrificante para os olhos para evitar a formação de lesões oculares, dessecação da córnea ou úlcera.
4. Antes de prosseguir, certifique-se do plano adequado de anestesia realizando um teste de resposta à pinça do dedo do pé.
5. Preparar a área cirúrgica do animal antes de colocá-lo no campo cirúrgico asséptico e coberto.
   1. Em seguida, raspe as áreas inguinal e escrotal do mouse usando um par de cortadores.
      OBS: Depilar o abdome inferior superior ao pênis permitirá melhor visualização durante a cirurgia.
   2. Usando um aplicador colado em algodão, aplique uma fina camada de creme depilatório (ver Tabela de Materiais) na pele do animal, cobrindo o escroto e a área circundante que acabou de ser raspada. Aguarde 30 s e retire o creme com um pedaço de gaze limpa.
   3. Use esponjas de gaze embebidas em etanol a 70% para limpar qualquer creme e cabelo restante da área.
      OBS: O etanol 70% nesta etapa é para auxiliar na remoção completa do creme depilatório. A preparação antisséptica do sítio cirúrgico é realizada na etapa 1.8.
6. Transfira o rato para a área cirúrgica e certifique-se de que existe uma fonte de calor disponível para manter a temperatura corporal do animal durante a operação. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre um pano cirúrgico e use fita adesiva macia para aderir os pés do rato ao tapete cirúrgico.
7. Se os testículos ascenderem para o abdômen, palpar cuidadosamente o abdômen para que os testículos desçam. Use uma mão enluvada para aplicar uma pressão suave de rolamento para baixo no abdômen.
   NOTA: É mais fácil realizar esta cirurgia sob um escopo de dissecção ou usando um par de lupas para aumentar a ampliação. Se estiver executando isso sob um escopo de dissecação, reserve um momento para posicionar o escroto do mouse sob o campo visual do escopo. Uma fita macia pode ser usada para aderir as pernas ou o abdômen do mouse ao campo cirúrgico para garantir que ele permaneça no posicionamento correto.
8. Esfregue a pele com esfoliação cirúrgica Betadine (ou uma esfoliação de preparação de pele antisséptica semelhante), seguida de esfoliação com álcool a 70% pelo menos três vezes para garantir a desinfecção adequada da pele. Para cada esfoliação, esfregue em um movimento radial para fora, de modo que o meio do local da incisão seja esfregado primeiro e terminando com a borda externa da área cirúrgica raspada sendo esfregada por último.
9. Neste momento, coloque luvas cirúrgicas estéreis. Para os próximos passos do procedimento, utilize técnicas assépticas. Cubra o rato com um pano cirúrgico estéril com uma pequena incisão (cortada a aproximadamente 0,5-1 polegada quadrada para caber sobre o local cirúrgico) sobre o animal para cobrir o corpo no material do drape.
10. Crie uma incisão ventral na linha média no escroto de aproximadamente 1 cm a 1,5 cm de comprimento usando uma lâmina de bisturi cirúrgico ou instrumentos semelhantes seguindo suas diretrizes institucionais de bem-estar animal aprovadas.
11. Segurando a borda cortada da pele, use um instrumento de ponta romba para separar a pele do tecido inferior. Reserve um tempo para fazer isso nas bordas lateral, superior e inferior da incisão.
12. Isole um testículo usando a espátula e a pinça para mover a incisão na pele para ser centralizada em cima de um dos testículos. Se isso for difícil, volte para 1.11 e separe ainda mais a pele das camadas inferiores.
13. Pegue um par de pinças curvas e coloque-as em cada lado do testículo. Aplique uma pressão suave para baixo para exteriorizar o testículo. Pegue a camada fina e transparente de músculo que está em cima do testículo usando pinças. Este é o músculo cremaster. A verificação da camada muscular correta é feita observando-se essa camada e sua circulação, movendo-se independentemente do testículo abaixo dela.
    NOTA: A identificação do tecido correto é confirmada pela sua transparência e capacidade de se mover independentemente dos tecidos subjacentes.
    1. Manipular o tecido muscular usando pinças até que o ápice do músculo seja agarrado. Esta deve ser a porção mais baixa, com os testículos e cauda do epidídimo localizados abaixo.
14. Segure o músculo cremaster com pinças e afaste-se suavemente dos testículos e do epidídimo. Crie uma incisão de 0,5 cm através do músculo cremaster do primeiro testículo em seu ápice usando um pequeno par de tesouras de mola Vannas.
15. Coloque uma pinça de bloqueio na borda posterior do músculo cremaster cortado. Use um par estreito de hemostáticos ou um par de porta-microagulhas de bloqueio. Uma vez que o tecido é pinçado, coloque suavemente o instrumento no lado lateral do mouse para manter o tecido preso durante as etapas seguintes do procedimento.
16. Utilizar pinça para agarrar a borda superior da incisão feita no passo 1.14. Enquanto as duas extremidades do músculo cremaster estão sendo retraídas, use outro par de pinças para alcançar dentro da cavidade e segure suavemente o testículo.
    1. Puxe-o para fora através do orifício no músculo. Tenha cuidado para observar quaisquer sinais de vasos sanguíneos cortados e sangue no campo cirúrgico.
    2. O testículo, o epidídimo, o cordão espermático anexado e o vaso sanguíneo serão aparentes quando os tecidos estiverem devidamente exteriorizados.
    3. Próximo à extremidade caudal-dorsal do epidídimo e testículo, há um ponto fibroso de fixação do testículo ao músculo cremaster. Enrole o tecido exteriorizado lateralmente para localizar esse ponto de inserção. Separar isso para evitar danos ao músculo e permitir maior isolamento e visualização dos tecidos. Use dois pares de pinças para realizar uma técnica de pinça e rasgo.
17. Procure tecido gorduroso ao redor do testículo do coxim gorduroso inguinal. Use um par de pinças para agarrar a almofada de gordura e puxe suavemente para exteriorizá-la.
    1. Não pegue o vaso sanguíneo que viaja ao longo da almofada de gordura, pois puxar isso pode levar à hemorragia.
18. Localize o cordão espermático, os vasos sanguíneos e o coxim adiposo remanescente que está proximal aos tecidos exteriorizados e use um par de hemostáticos para fixá-lo. Enquanto mantém uma leve tensão no testículo distal, cauterize o cordão espermático e os vasos sanguíneos distais à pinça do hemostático.
    1. Uma vez completa, solte lentamente a pinça proximal à extremidade cauterizada e verifique se há sinais de sangramento. Se presente, repita esta etapa. É útil usar um par de pinças para manter a tensão suave na extremidade distal do tecido que está sendo cauterizado.
19. Permita que o coto cortado do cordão espermático se retraia de volta para o corpo. Pegue as duas pontas cortadas do músculo cremaster e junte-as. Avaliar o tamanho do corte no tecido e fechar o tecido com suturas absorvíveis 4-0 ou 5-0. Dependendo do tamanho da incisão, serão necessárias 1 ou 2 suturas. Aparar as extremidades da sutura até 0,5 cm usando tesoura de sutura.
20. Repita os passos 1.13-1.20 do outro lado do escroto para remover o segundo testículo.
21. Prepare-se para fechar a incisão na pele.
    1. Garantir boa hemostasia de ambos os cotos teciduais. Hemostasia deficiente resultará em sangramento residual no campo cirúrgico. Se isso ocorrer, localize o sangramento e cauterize. Isso é evitado pela manipulação lenta e cuidadosa dos tecidos com instrumentos contusos.
    2. Se houver sangue no campo cirúrgico, utilizar aplicador esterilizado com ponta de algodão para secar a área para melhor visualização. Use uma seringa para pingar soro fisiológico na área para irrigar qualquer sangue ou líquido longe do campo cirúrgico.
22. Puxe os dois lados da incisão da pele juntos para prepará-la para o fechamento. Certifique-se de que as extremidades suturadas das incisões cremaster não estejam se projetando para a incisão da pele. Se necessário, corte ainda mais as extremidades da sutura.
23. Feche a pele.
    1. Se estiver usando clipes de ferida, use pinças para evertar a pele e puxá-la para longe do tecido subjacente. Coloque um clipe da ferida centrado sobre a incisão. Verifique se a pele está bem cortada. Se a incisão for ligeiramente grande demais para que um clipe da ferida possa fechá-la suficientemente, a cola cirúrgica da pele pode ser aplicada nas porções superior e inferior da incisão.
    2. Se estiver usando suturas, coloque o número necessário de suturas através da pele, sem agarrar o tecido subjacente. Este tipo de incisão exigirá 2-3 suturas únicas interrompidas usando material de sutura inabsorvível 4-0.
24. Limpe a pele ao redor do local cirúrgico suavemente com soro fisiológico e um aplicador esterilizado com ponta de algodão para remover qualquer sangue seco ou esfoliação antisséptica residual.

2. Ovariectomia murina

1. Prepare um campo de trabalho asséptico e certifique-se de que os instrumentos cirúrgicos necessários foram esterilizados e estão prontamente disponíveis. Siga práticas assépticas para cirurgia de sobrevivência de roedores.
2. Registre o peso do camundongo fêmea e administre o método de anestesia preferido de acordo com suas diretrizes institucionais. Nesse protocolo, isoflurano a 2% foi administrado por vaporizador de precisão para manutenção da anestesia. Antes do procedimento, administre medicamentos para dor de acordo com suas diretrizes institucionais. Nesse protocolo, 1,0 mg/kg de Buprenorfina SR e 5 mg/kg de Meloxicam foram administrados por via subcutânea.
3. Administrar gel lubrificante nos olhos do animal para evitar a formação de lesões oculares, dessecação da córnea ou úlcera. Certifique-se de que uma fonte de calor esteja disponível para manter a temperatura corporal do animal durante a operação. Certifique-se do plano adequado de anestesia verificando se há uma resposta de pinça do dedo do pé.
4. Preparar a área cirúrgica do animal antes de colocá-lo no campo cirúrgico.
   1. Faça a barba suave dos pelos na região dorsolateral das costas do animal usando um par de cortadores. Remova os pelos da região acima da borda superior dos quadris e abaixo da borda inferior da caixa torácica, bem como das áreas entre esses pontos de referência.
   2. Usando um aplicador com ponta de algodão, aplique uma camada de creme depilatório na pele do animal, cobrindo a área que acabou de ser raspada. Aguarde 30 s e retire o creme com um pedaço de gaze, retirando os pelos finos que restam.
   3. Use uma esponja de gaze embebida em etanol a 70% para limpar qualquer creme e cabelo restante da área cirúrgica.
      OBS: O etanol 70% nesta etapa é para auxiliar na remoção completa do creme depilatório. O preparo antisséptico do sítio cirúrgico é realizado na etapa 2.5.
5. Coloque o animal na posição lateral (para incisão para remover um ovário de cada vez) no campo cirúrgico e certifique-se de que uma fonte de calor está disponível. Esfregue a área operatória com esfoliação cirúrgica Betadine (ou uma esfoliação antisséptica semelhante à preparação da pele), seguida de álcool a 70% pelo menos três vezes para garantir a desinfecção adequada da pele. Para cada esfoliação, esfregue em um movimento radial para fora, de modo que o meio da incisão seja esfregado primeiro e a borda externa da área cirúrgica raspada seja esfregada por último.
6. Neste momento, coloque luvas cirúrgicas estéreis. Para os próximos passos do procedimento, utilize técnicas assépticas. Coloque um pano cirúrgico com uma pequena incisão (corte um quadrado de aproximadamente 0,5-1 polegada no drape para caber no local cirúrgico) sobre o animal para que o corpo seja coberto com material de drape.
7. Localize o local ideal para a incisão cirúrgica encontrando o ponto médio entre os quadris e as costelas do mouse (ver Figura 2). Segure a pele com pinça e faça uma incisão de 1,0 cm na pele neste local.
8. Use um instrumento de ponta romba (sonda, espátula cirúrgica ou hemostáticos com ponta romba) para separar a pele do tecido muscular inferior. Reserve um tempo para fazer isso nas bordas lateral, superior e inferior da incisão.
9. Localizar a parede muscular dorsolateral do abdome. Se necessário, remova o tecido adiposo que fica entre a pele e as camadas musculares. Em camundongos maduros, esse tecido adiposo é mais proeminente. Mova esse tecido adiposo em direção à extremidade caudal do camundongo, expondo a parede muscular.
   1. O tecido adiposo é diferenciado da parede abdominal pela cor: o tecido adiposo parece branco pálido e fica mais superficial, enquanto a parede abdominal aparece rósea e fica mais profunda do que o tecido adiposo.
10. Segure a parede abdominal com pinça de dente de rato e faça uma incisão de 0,5 cm nela.
11. Pegue uma borda dessa incisão com um par de pinças, use um segundo par para alcançar dentro da cavidade do corpo e encontre o ovário, o corno uterino e o coxim gorduroso. Puxe-o suavemente através da incisão na parede muscular para separar o músculo do tecido subjacente e exteriorizá-lo. Localize a transição entre o corno uterino e o ovário.
12. Separe o ovário realizando uma técnica de esmagamento e rasgo.
    1. Coloque uma pinça na extremidade distal do corno uterino e coloque a segunda pinça apenas distal à primeira. Ao aplicar pressão firme com ambas as pinças, afaste a mais distal do corpo, rasgando a conexão entre elas. Para minimizar o sangramento e o dano tecidual, mantenha a pinça proximal estacionária durante esse processo e tenha cuidado para não afastá-la também do corpo.
    2. Alternativamente, use um cautério. Use um par de pinças ou hemostáticos para pinçar o corno uterino apenas proximal ao ponto de cautério desejado. Use uma ferramenta de cautério para cortar os tecidos.
13. Solte suave e lentamente a pinça proximal e verifique se há sinais de sangramento.
14. Permita que o coto de tecido recue para a cavidade do corpo. Agarre a parede abdominal e puxe suavemente para cima. Não force o coto de tecido para dentro, pois isso aumenta a probabilidade de sangramento.
15. Localize as bordas da incisão na parede muscular e junte-as para se preparar para suturá-la.
16. Coloque 1-2 suturas únicas interrompidas na parede muscular abdominal usando material de sutura absorvível 4-0. Aparar as extremidades da sutura até 0,5 cm usando tesoura de sutura.
17. Fechar a incisão permitindo que a pele retorne ao seu estado natural de repouso e, em seguida, evertê-la para cima, tomando cuidado para não agarrar o tecido subjacente ou as extremidades do material de sutura. Coloque 1-2 clipes de ferida na pele evertida. Com base em suas diretrizes institucionais, a pele também pode ser fechada com material de sutura inabsorvível 4-0.
18. Para remover o outro ovário, mude a posição do mouse para ter o outro lado voltado para cima. Seja suave ao mudar a posição do rato para não colocar muita pressão sobre a pele cortada da ferida a partir do passo 2.17.
19. Neste lado, repita as etapas 2.5 - 2.17.
20. Limpe a pele ao redor do local cirúrgico suavemente com soro fisiológico e um aplicador esterilizado com ponta de algodão para remover qualquer sangue seco ou esfoliação antisséptica residual.

3. Cuidados pós-operatórios

1. De acordo com suas diretrizes institucionais, administre medicamentos para dor por até 72 h pós-operatório. Documentar o procedimento cirúrgico dos animais, anotando a data, hora, anestésico e analgésico utilizado. Aqui, a buprenorfina de liberação lenta e meloxicam é administrada no pré-operatório.
2. Após a conclusão da cirurgia dos animais, transfira-os para uma gaiola limpa forrada com uma toalha de papel seca. Coloque esta gaiola 2/3 em uma fonte de calor, deixando o outro 1/3 da gaiola fora do fogo. Não coloque ratos juntos em uma gaiola até que eles tenham se recuperado da anestesia.
3. Permita que o animal recupere a capacidade de andar livremente ao redor da gaiola antes de colocá-lo de volta em uma gaiola limpa com cama de animal normal. Neste momento, os ratos podem ser alojados juntos se todos tiverem se recuperado da anestesia.
4. Nos primeiros dias após a cirurgia, certifique-se de que a comida e a água úmidas sejam facilmente acessíveis. Coloque alguns alimentos umedecidos no fundo da gaiola. Verifique frequentemente o local cirúrgico do mouse e procure sinais de infecção ou sangramento.
5. Após a cirurgia, certifique-se de que os ratos sejam alojados sozinhos ou com outros animais que tenham sido submetidos ao mesmo procedimento simultaneamente. Um camundongo que se recupera de uma cirurgia localizada na mesma gaiola que um sem cirurgia pode apresentar um risco e deve ser evitado.
6. Para camundongos que foram submetidos à ooforectomia e têm clipes de feridas nos lados dorsolaterais das costas, remova quaisquer habitats de iglu de roedores da gaiola para reduzir a chance de o clipe da ferida do rato ficar preso no iglu durante a primeira semana de cicatrização.
7. Continue monitorando o animal em busca de sinais de infecção, dor ou complicações cirúrgicas a cada 12 h durante as primeiras 72 h do tempo de cicatrização.
8. Remova clipes de ferida usando uma ferramenta de remoção de clipe de ferida 10-14 dias após a cirurgia.

Resultados

O procedimento aqui apresentado é realizado em camundongos de um a três meses de idade no fundo C57BL/6J. Camundongos machos pesavam 16-28 g, e camundongos fêmeas pesavam 14-24 g no momento do procedimento. Este procedimento foi otimizado para ser aplicável em camundongos de várias idades, desde o desmame até a idade adulta.

A orquiectomia cirúrgica envolve uma única incisão cutânea no saco escrotal ventral, como mostra a Figura 1A. Ambos os testículos ...

Discussão

A remoção cirúrgica de testículos e ovários permite estudar a fisiologia murina sob privação hormonal controlada. Essa técnica é importante para vários campos da ciência, incluindo neurodegeneração, metabolismo mineral, saúde cardiovascular e reprodutiva 15,16,17,18,19,20,21. A...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Syringe	BD	309659
30G 1/2" Needle	BD	305106
AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Betadine Solution	Fisher Scientific	NC0158124
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	10-000-692
Double -ended Micro Spatula	Fine Science Tools	10091-12
Galilean Loupes	Fine Science Tools	28050-30	Optional, can provide better clarity during procedure
Gauze Sponges, 4"x4"	Fisher Scientific	13-761-52
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
High Temp Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Using the fine tip attachment
Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13
PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN	Covetrus	29242	4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best
Rodent Warming pad	Kent Scientific	RT-0515
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Straight Locking Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Surgical Scissors	Fine Science Tools	140-60-09
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream	Amazon	N/A
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