Мышиная орхиэктомия и овариоэктомия для снижения выработки половых гормонов

Резюме

В этой рукописи описывается последовательный способ быстрого выполнения орхиэктомии и овариэктомии грызунов, выживающих грызунов.

Аннотация

Передача сигналов половых гормонов играет важнейшую роль в развитии нескольких систем органов, а также в прогрессировании различных заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания. Манипуляции с уровнями половых гормонов в мышиной модельной системе позволяют изучать их влияние на органы/ткани и в рамках прогрессирования заболевания. Орхиэктомия - хирургическое удаление яичек - и овариоэктомия - хирургическое удаление яичников - представляют собой метод истощения эндогенных половых гормонов, чтобы точный уровень гормонов мог быть обеспечен с помощью лекарств или других методов доставки. Здесь мы предлагаем быстрые и минимально инвазивные методы как орхиэктомии, так и овариоэктомии в мышиной модельной системе для снижения уровня половых гормонов. В этом протоколе подробно описывается хирургическая подготовка и иссечение яичек через мошоночный мешок, а также иссечение яичников через два разреза в правой и левой боковой тыльной стороне.

Введение

Яички и яичники являются основными органами, ответственными за выработку половых гормонов. Каскад гормональных коммуникаций, приводящих к выработке тестостерона и эстрогена, является хорошо охарактеризованным процессом, который начинается в гипоталамусе с высвобождения гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ)¹. Высвобождение ГнРГ вызывает высвобождение лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза. Когда эти гормоны попадают в кровоток, они затем влияют на другие ткани в организме. Основной мишенью ЛГ являются яички (у мужчин) и яичники (у женщин)². В ответ на ЛГ яички вырабатывают и высвобождают тестостерон³. Аналогично яичники вырабатывают эстроген⁴. В то время как эти гормоны предназначены для подготовки клеток и организма к оплодотворению и обеспечения функционирования репродуктивной системы, многие другие системы организма могут быть затронуты.

Половые гормоны связаны с несколькими физиологическими функциями. Например, эстроген помогает поддерживать гомеостаз костей, предотвращая резорбцию кости остеокластами. По этой причине овариэктомированные мышиные модели могут быть использованы для изучения физиологии заболеваний костей, таких как остеопороз ^5,6,7. Тестостерон и эстроген также являются объектами исследований многих сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. В последнее время повышенная выработка тестостерона в сочетании с диетой с высоким содержанием жиров была связана с сосудистым окислительным^{стрессом}. В головном мозге изменения ЛГ после овариоэктомии вызвали изменения в пространственной памяти⁹. Снижение уровня эстрогенов после овариоэктомии также стало модельной системой для изучения гибели клеток в гиппокампе, поскольку это может индуцировать апоптоз, приводящий к^{дефициту памяти}. Тестостерон также показал свою роль в росте почек как у мышей, так и у людей после^{трансплантации} почки.

Создание лишенной гормонов мышиной модели позволяет изучать половые гормоны и их гормональные каскады на различных заболеваниях или тканях. Это может быть достигнуто путем хирургического удаления яичек (орхиэктомия) или яичников (овариоэктомия). Эта процедура может быть проведена на мышах любой линии в возрасте от отъема (21 день) или в любом взрослом возрасте. Овариоэктомия выполняется самкам мышей, в то время как орхиэктомия выполняется самцам мышей. Удаляя эти органы, можно^{значительно снизить уровень} эстрогена и тестостерона, а также многих их производных, таких как прогестерон. Процесс выполнения орхиэктомии или овариоэктомии у мышей может быть быстрым и минимально инвазивным при правильной технике. Быстрое иссечение этих органов безопасным и эффективным способом может обеспечить быструю хирургическую обработку, сохраняя при этом минимальное количество мышей за счет 100% выживаемости при правильном выполнении. Здесь мы подробно опишем протокол быстрого иссечения яичек и яичников и продемонстрируем надлежащий послеоперационный мониторинг, чтобы исследователи могли выполнить эту операцию быстро и безопасно. Мы также включаем визуальные примеры половых органов и окружающих тканей, чтобы предоставить хирургу анатомические ориентиры при выполнении этой процедуры.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в UTSW (APN#2019-102840).

1. Мышиная орхиэктомия

1. Подготовьте асептическое рабочее поле и убедитесь, что необходимые хирургические инструменты стерилизованы и легко доступны. Соблюдайте асептические методы хирургического вмешательства при выживании грызунов.
2. Запишите вес самца мыши и назначьте предпочтительный метод анестезии в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом протоколе 2% изофлуран доставлялся через прецизионный испаритель для поддержания анестезии. Перед процедурой введите обезболивающее лекарство в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом протоколе 1,0 мг/кг бупренорфина SR и 5 мг/кг мелоксикама вводили подкожно.
3. После того, как мышь находится под наркозом, прикройте глаза животного смазывающим гелем для глаз, чтобы избежать образования травмы глаза, высыхания роговицы или язвы.
4. Прежде чем продолжить, убедитесь в правильности анестезии, выполнив тест на защемление пальца ноги.
5. Подготовьте прооперированную область животного, прежде чем поместить его на асептическое, задрапированное операционное поле.
   1. Далее побрейте паховую и мошоночную области мыши с помощью ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье нижней части живота выше пениса позволит улучшить визуализацию во время операции.
   2. С помощью ватного аппликатора нанесите тонкий слой крема для депиляции (см. Таблицу материалов) на кожу животного, покрывая мошонку и прилегающую область, которая только что была выбрита. Подождите 30 с и снимите крем кусочком чистой марли.
   3. Используйте марлевые губки, пропитанные 70% этанолом, чтобы стереть остатки крема и волосы с этой области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанола на этом этапе помогает полностью удалить крем для депиляции. Антисептическая подготовка операционного поля проводится на этапе 1.8.
6. Перенесите мышь в операционную область и убедитесь, что источник тепла доступен для поддержания температуры тела животного во время операции. Поместите животное в положение лежа на спине на хирургической простыне и используйте мягкую клейкую ленту, чтобы приклеить лапки мыши к хирургическому коврику.
7. Если яички поднимаются в брюшную полость, осторожно пальпируйте брюшную полость, чтобы яички опустились. Рукой в перчатке слегка надавите вниз на живот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту операцию легче проводить под препарированием или с использованием пары луп для увеличения увеличения. Если вы выполняете эту операцию под эндоскопом для вскрытия, найдите время, чтобы расположить мошонку мыши под полем зрения эндоскопа. Мягкую ленту можно использовать для приклеивания лапок или живота мыши к операционному полю, чтобы гарантировать, что она останется в правильном положении.
8. Потрите кожу хирургическим скрабом Бетадин (или аналогичным антисептическим скрабом для подготовки кожи), а затем скрабом с 70% спиртом не менее трех раз, чтобы обеспечить надлежащую дезинфекцию кожи. Для каждого скраба скрабируйте радиальными движениями наружу, чтобы сначала очищалась середина места разреза, а в последнюю очередь очищалась внешняя граница выбритой хирургической области.
9. В это время наденьте стерильные хирургические перчатки. Для следующих этапов процедуры используют асептические методики. Накройте мышь стерильной хирургической простыней с небольшим разрезом (разрезанным примерно до 0,5-1 дюйма квадрата, чтобы поместиться над местом операции) поверх животного, чтобы покрыть тело тканью драпировки.
10. Сделайте вентральный срединный разрез в мошонке длиной примерно 1-1,5 см с помощью лезвия хирургического скальпеля или аналогичных инструментов в соответствии с утвержденными вами рекомендациями по защите животных.
11. Взявшись за разрезанный край кожи, с помощью инструмента с тупым концом отделите кожу от нижней ткани. Потратьте время на то, чтобы сделать это на боковой, верхней и нижней границах разреза.
12. Изолируйте яичко, используя шпатель и щипцы, чтобы переместить разрез на коже, чтобы он был сосредоточен на одном из яичек. Если это затруднительно, вернитесь к версии 1.11 и отделите кожу от нижних слоев.
13. Возьмите пару изогнутых щипцов и поместите их по обе стороны от яичка. Слегка надавите вниз, чтобы экстериоризировать яичко. Захватите тонкий, прозрачный слой мышцы, который находится на верхней части яичка, с помощью щипцов. Это кремастерная мышца. Проверка правильности мышечного слоя производится путем наблюдения за этим слоем и его циркуляцией, движущейся независимо от яичка под ним.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация правильной ткани подтверждается ее прозрачностью и способностью двигаться независимо от подлежащих тканей.
    1. Манипулируйте мышечной тканью с помощью щипцов до тех пор, пока верхушка мышцы не будет захвачена. Это должна быть самая нижняя часть, под которой расположены яички и придаток хвоста.
14. Захватите кремастерную мышцу щипцами и осторожно отойдите от яичек и придатка яичка. Сделайте разрез 0,5 см через кремастерную мышцу первого яичка на его вершине с помощью небольших пружинных ножниц Vannas.
15. Наложите фиксирующий зажим на задний край разрезанной кремастерной мышцы. Используйте узкую пару гемостатов или пару фиксирующих микроиглодержателей. После того, как ткань будет пережата, осторожно положите инструмент на боковую сторону мыши, чтобы сохранить ткань зажатой во время следующих процедурных шагов.
16. С помощью щипцов захватите верхнюю границу разреза, сделанного на шаге 1.14. В то время как два конца кремастерной мышцы втягиваются, используйте другую пару щипцов, чтобы проникнуть внутрь полости и осторожно захватить яичко.
    1. Потяните его наружу через отверстие в мышце. Будьте внимательны, следите за любыми признаками поврежденных кровеносных сосудов и крови в операционном поле.
    2. Яичко, придаток яичка, присоединенный семенной канатик и кровеносный сосуд будут видны, когда ткани будут должным образом экстернализированы.
    3. Возле каудально-дорсального конца придатка яичка и яичка находится фиброзная точка прикрепления яичка к кремастерной мышце. Сверните экстериоризованную ткань в сторону, чтобы найти эту точку введения. Отрежьте его, чтобы избежать повреждения мышцы и обеспечить дальнейшую изоляцию и визуализацию тканей. Используйте две пары щипцов для выполнения техники зажима и разрыва.
17. Ищите жировую ткань вокруг яичка из паховой жировой подушки. Используйте щипцы, чтобы захватить жировую комок, и осторожно потяните, чтобы сделать ее экстериоризирующей.
    1. Не захватывайте кровеносный сосуд, который проходит вдоль жировой комки, так как потягивание за него может привести к кровоизлиянию.
18. Найдите семенной канатик, кровеносные сосуды и оставшийся жировой пакет, который находится проксимальнее экстериоризированных тканей, и используйте пару гемостатов, чтобы пережать его. Удерживая небольшое напряжение на дистальном отделе яичка, прижигают семенной канатик и кровеносные сосуды дистальнее зажима гемостата.
    1. После завершения медленно отпустите зажим проксимальнее прижигаемого конца и проверьте наличие признаков кровотечения. Если присутствует, повторите этот шаг. Полезно использовать щипцы для удержания мягкого натяжения на дистальном конце прижигаемой ткани.
19. Дайте отрезанному культе семенного канатика втянуться обратно в тело. Возьмитесь за два отрезанных конца кремастерной мышцы и соедините их вместе. Оцените размер разреза в ткани и закройте ткань с помощью рассасывающихся швов 4-0 или 5-0. В зависимости от размера разреза потребуется 1 или 2 шва. Обрежьте концы шва до 0,5 см с помощью шовных ножниц.
20. Повторите шаги 1.13-1.20 с другой стороны мошонки, чтобы удалить второе яичко.
21. Подготовьтесь закрыть разрез кожи.
    1. Обеспечивают хороший гемостаз обеих культей тканей. Плохой гемостаз приведет к остаточному кровотечению в операционном поле. Если это произошло, локализуйте кровотечение и прижгите. Этого можно избежать медленными и осторожными манипуляциями с тканями тупыми инструментами.
    2. Если в операционном поле видна кровь, используйте стерилизованный аппликатор с ватным наконечником, чтобы высушить область для лучшей визуализации. Используйте шприц, чтобы закапать физиологический раствор на эту область, чтобы промыть кровь или жидкость подальше от операционного поля.
22. Стяните обе стороны разреза кожи, чтобы подготовить его к закрытию. Убедитесь, что зашитые концы разрезов кремастера не выступают в разрез кожи. При необходимости дополнительно обрежьте концы шва.
23. Закройте кожу.
    1. При использовании зажимов для ран используйте щипцы, чтобы вывернуть кожу и оттянуть ее от подлежащих тканей. Поместите один зажим для раны по центру разреза. Убедитесь, что кожа хорошо подстрижена. Если разрез слишком велик для того, чтобы один зажим для раны мог его закрыть, хирургический кожный клей может быть нанесен на верхнюю и нижнюю части разреза.
    2. При наложении швов необходимо наложить необходимое количество швов через кожу, не захватывая подлежащие ткани. Этот тип разреза потребует наложения 2-3 одинарных прерывистых швов с использованием нерассасывающегося шовного материала 4-0.
24. Осторожно очистите кожу вокруг места операции физиологическим раствором и стерилизованным аппликатором с ватным наконечником, чтобы удалить засохшую кровь или остатки антисептического скраба.

2. Мышиная овариоэктомия

1. Подготовьте асептическое рабочее поле и убедитесь, что необходимые хирургические инструменты стерилизованы и легко доступны. Соблюдайте асептические методы хирургического вмешательства при выживании грызунов.
2. Запишите вес самки мыши и назначьте предпочтительный метод анестезии в соответствии с рекомендациями вашего учреждения. В этом протоколе 2% изофлуран доставлялся через прецизионный испаритель для поддержания анестезии. Перед процедурой примите обезболивающее лекарство в соответствии с рекомендациями вашего учреждения. В этом протоколе 1,0 мг/кг бупренорфина SR и 5 мг/кг мелоксикама вводили подкожно.
3. Нанесите смазывающий гель на глаза животного, чтобы избежать травмы глаза, высыхания роговицы или язвы. Убедитесь, что имеется источник тепла для поддержания температуры тела животного во время операции. Обеспечьте надлежащую плоскость анестезии, проверив реакцию на защемление пальца ноги.
4. Подготовьте операционную область животного перед помещением его в операционное поле.
   1. Аккуратно сбрейте шерсть на дорсолатеральной области спины животного с помощью машинки для стрижки. Удалите волосы в области выше верхней границы бедер и ниже нижней границы грудной клетки, а также в областях между этими ориентирами.
   2. С помощью ватного аппликатора нанесите слой крема для депиляции на кожу животного, покрывая только что выбритую область. Подождите 30 с и снимите крем кусочком марли, удалив мелкие волоски, которые остались.
   3. Используйте марлевую губку, пропитанную 70% этанолом, чтобы вытереть остатки крема и волосы с прооперированной области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 70% этанола на этом этапе помогает полностью удалить крем для депиляции. Антисептическая подготовка операционного поля выполняется на этапе 2.5.
5. Поместите животное в боковое положение (для разреза для удаления одного яичника за раз) в операционном поле и убедитесь, что источник тепла доступен. Протрите операционную область хирургическим скрабом Бетадин (или аналогичным антисептическим скрабом для подготовки кожи) с последующим использованием 70% спирта не менее трех раз, чтобы обеспечить надлежащую дезинфекцию кожи. Для каждого скраба скрабируйте радиальными движениями наружу, чтобы сначала очищалась середина разреза, а затем зачищалась внешняя граница выбритой хирургической области.
6. В это время наденьте стерильные хирургические перчатки. Для следующих этапов процедуры используют асептические методики. Наденьте хирургическую простыню с небольшим разрезом (вырежьте квадрат примерно 0,5-1 дюйма в простыне, чтобы она соответствовала месту операции) на животное так, чтобы тело было покрыто драповым материалом.
7. Найдите идеальное место для хирургического разреза, найдя середину между бедрами и ребрами мыши (см. рисунок 2). Захватите кожу щипцами и сделайте надрез на коже в этом месте на 1,0 см.
8. Используйте инструмент с тупым концом (зонд, хирургический шпатель или гемостаты с тупым наконечником), чтобы отделить кожу от нижней мышечной ткани. Потратьте время на то, чтобы сделать это на боковой, верхней и нижней границах разреза.
9. Найдите дорсолатеральную мышечную стенку живота. При необходимости удалите жировую ткань, которая находится между кожным и мышечным слоями. У половозрелых мышей эта жировая ткань более заметна. Переместите эту жировую ткань к каудальному концу мыши, обнажив мышечную стенку.
   1. Жировая ткань дифференцируется от брюшной стенки по цвету: жировая ткань выглядит бледно-белой и лежит более поверхностно, в то время как брюшная стенка кажется розовой и залегает глубже, чем жировая ткань.
10. Захватите брюшную стенку щипцами из крысиного зуба и сделайте в ней надрез 0,5 см.
11. Захватите один край этого разреза одной парой щипцов, второй парой проникните внутрь полости тела и найдите яичник, рог матки и жировую подушку. Осторожно протяните его через разрез в мышечной стенке, чтобы отделить мышцу от подлежащей ткани и экстериоризировать ее. Найдите переход между рогом матки и яичником.
12. Разрежьте яичник, выполнив технику раздавливания и разрыва.
    1. Наложите один зажим на дистальный конец рога матки, а второй зажим расположите дистальнее первого. При сильном надавливании обоими зажимами отодвиньте более дистальный от тела, разрывая соединение между ними. Чтобы свести к минимуму кровотечение и повреждение тканей, держите проксимальный зажим неподвижным во время этого процесса и будьте осторожны, чтобы не оттянуть его от тела.
    2. В качестве альтернативы можно использовать прижигание. Используйте щипцы или гемостатики, чтобы пережать рог матки чуть проксимальнее желаемой точки прижигания. Используйте инструмент для прижигания, чтобы разрезать ткани.
13. Осторожно и медленно отпустите проксимальный зажим и проверьте наличие признаков кровотечения.
14. Дайте культе ткани отступить в полость тела. Возьмитесь за брюшную стенку и осторожно потяните вверх. Не проталкивайте культю ткани внутрь, так как это увеличивает вероятность кровотечения.
15. Найдите границы разреза в мышечной стенке и сведите их вместе, чтобы подготовиться к наложению швов.
16. Наложите 1-2 одинарных прерывистых шва на стенку мышц брюшной полости, используя рассасывающийся шовный материал 4-0. Обрежьте концы шва до 0,5 см с помощью шовных ножниц.
17. Закройте разрез, позволив коже вернуться в свое естественное состояние покоя, а затем выверните его вверх, стараясь не зацепить подлежащие ткани или концы шовного материала. Поместите 1-2 раневых зажима на вывернутую кожу. В соответствии с рекомендациями вашего учреждения, кожа также может быть закрыта с помощью нерассасывающегося шовного материала 4-0.
18. Чтобы удалить другой завязь, поменяйте положение мыши так, чтобы другая боковая сторона была обращена вверх. Будьте осторожны при смене положения мыши, чтобы не оказывать слишком сильного давления на обрезанную рану кожу, начиная с шага 2.17.
19. С этой стороны повторите шаги 2,5 - 2.17.
20. Осторожно очистите кожу вокруг места операции физиологическим раствором и стерилизованным аппликатором с ватным наконечником, чтобы удалить засохшую кровь или остатки антисептического скраба.

3. Послеоперационный уход

1. В соответствии с рекомендациями вашего учреждения, принимайте обезболивающие препараты в течение 72 часов после операции. Задокументируйте хирургическую процедуру животного, отметив дату, время, использованный анестетик и анальгетик. В этом случае перед операцией вводят бупренорфин с медленным высвобождением и мелоксикам.
2. После завершения операции животным пересадите их в чистую клетку, застеленную сухим бумажным полотенцем. Поместите эту клетку на 2/3 к источнику тепла, оставив остальные 1/3 клетки выключенными от огня. Не помещайте мышей вместе в клетку до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.
3. Дайте животному восстановить способность свободно ходить по клетке, прежде чем поместить его обратно в чистую клетку с обычной подстилкой. В это время мышей можно содержать вместе, если все они оправились от анестезии.
4. В течение первых нескольких дней после операции следите за тем, чтобы влажная пища и вода были легко доступны. Положите немного увлажненного корма на дно клетки. Часто проверяйте место операции мыши и ищите любые признаки инфекции или кровотечения.
5. После операции убедитесь, что мыши содержатся либо отдельно, либо с другими животными, которые прошли ту же процедуру одновременно. Мышь, выздоравливающая после операции, находящаяся в той же клетке, что и мышь без операции, может представлять опасность, и ее следует избегать.
6. Для мышей, перенесших овариоэктомию и имеющих раневые зажимы на дорсолатеральных сторонах спины, удалите из клетки все места обитания грызунов-иглу, чтобы уменьшить вероятность того, что зажим для раны мыши зацепится за иглу в течение первой недели заживления.
7. Продолжайте наблюдать за животным на предмет признаков инфекции, боли или хирургических осложнений каждые 12 часов в течение первых 72 часов заживления.
8. Через 10-14 дней после операции удалите зажимы для раны с помощью инструмента для удаления зажимов для раны.

Результаты

Процедура, представленная здесь, выполняется на мышах в возрасте от одного до трех месяцев на фоне C57BL/6J. Самцы мышей весили 16-28 г, а самки - 14-24 г на момент процедуры. Эта процедура была оптимизирована для мышей разных возрастов, от отъема до взрослого возраста.

Хирургическа...

Обсуждение

Хирургическое удаление яичек и яичников позволяет изучать физиологию мышей в условиях контролируемой гормональной депривации. Этот метод важен для многих областей науки, включая нейродегенерацию, минеральный обмен, сердечно-сосудистое и репродуктивное здоровье 15,16,17,18,19,20,21

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Syringe	BD	309659
30G 1/2" Needle	BD	305106
AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Betadine Solution	Fisher Scientific	NC0158124
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	10-000-692
Double -ended Micro Spatula	Fine Science Tools	10091-12
Galilean Loupes	Fine Science Tools	28050-30	Optional, can provide better clarity during procedure
Gauze Sponges, 4"x4"	Fisher Scientific	13-761-52
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
High Temp Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Using the fine tip attachment
Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13
PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN	Covetrus	29242	4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best
Rodent Warming pad	Kent Scientific	RT-0515
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Straight Locking Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Surgical Scissors	Fine Science Tools	140-60-09
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08
Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream	Amazon	N/A
Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue	Amazon	#9861-900