性ホルモン産生を減らすためのマウス精巣摘出術と卵巣摘出術

要約

この原稿では、生存げっ歯類の精巣摘出術と卵巣摘出術を迅速に行うための一貫した方法について説明しています。

要約

性ホルモンシグナル伝達は、複数の臓器系や神経変性疾患を含むさまざまな疾患の進行に重要な役割を果たしています。マウスモデルシステムにおける性ホルモンレベルの操作により、臓器/組織への影響や疾患の進行内への影響を研究することができます。精巣の外科的切除術(精巣の外科的切除)と卵巣摘出術(卵巣の外科的切除)は、内因性性ホルモンを枯渇させる方法を提供し、薬物やその他の送達方法によって正確なホルモンレベルを提供することができます。ここでは、性ホルモンを減少させるためのマウスモデルシステムにおける精巣摘出術と卵巣摘出術の両方に迅速かつ低侵襲な方法を提供します。このプロトコルは陰嚢を通る精巣の外科的準備そして切除、および右および左の外側背部の2つの切開による卵巣の切除を詳述する。

概要

精巣と卵巣は、性ホルモンの産生に関与する主要な器官です。テストステロンとエストロゲンの産生につながるホルモン伝達のカスケードは、視床下部でゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)^の放出とともに始まる、よく特徴付けられたプロセスです1。GnRHの放出は、下垂体からの黄体形成ホルモン(LH)と卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を引き起こします。これらのホルモンが血流に入ると、体内の他の組織に影響を与えます。LHの主な標的は、精巣(男性)と卵巣(女性)です²。LHに反応して、精巣はテストステロン³を産生し、放出します。同様に、卵巣はエストロゲン⁴を産生します。これらのホルモンの意図された効果は、受精のために細胞と体を準備し、生殖器系の機能を確保することですが、他の多くの身体システムが影響を受ける可能性があります。

性ホルモンは、いくつかの生理学的機能に関連しています。例えば、エストロゲンは破骨細胞による骨の吸収を防ぐことで、骨の恒常性を維持するのに役立ちます。このため、卵巣摘出マウスモデルを用いて、骨粗鬆症などの骨疾患の生理学を研究することができます^5,6,7。テストステロンとエストロゲンは、多くの心血管疾患や神経変性疾患の研究対象でもあります。最近では、テストステロン産生の上昇と高脂肪食が血管の^{酸化ストレスと}関連していることがわかっています8。脳では、卵巣摘出術後のLHの変化が^{空間記憶の変化}を引き起こしている9。卵巣摘出術後のエストロゲンの減少は、アポトーシスを誘発し、記憶障害を引き起こす可能性があるため、海馬の細胞死を研究するためのモデルシステムにもなっています¹⁰。テストステロンは、腎臓移植後のマウスモデルとヒトの両方で腎臓の成長にも関与していることが示されています¹¹。

ホルモン欠乏マウスモデルの作成により、性ホルモンとそのホルモンカスケードがさまざまな疾患や組織に蓄積される様子を研究することができます。これは、精巣の外科的切除(精巣摘出術)または卵巣切除術(卵巣摘出術)によって達成できます。この手順は、離乳年齢(21日)または成人年齢の若いマウスで実行できます。卵巣摘出術は雌マウスで行われ、精巣摘出術は雄マウスで行われます。これらの器官を取り除くことにより、エストロゲンとテストステロンのレベル、およびプロゲステロンなどのそれらの誘導体の多くは、大幅に減少させることができます^12,13。マウスで精巣摘出術または卵巣摘出術を行うプロセスは、適切な技術で迅速かつ低侵襲にすることができます。これらの臓器を安全かつ効率的に迅速に切除することで、正しく行えば100%の生存率が得られ、マウスの数を最小限に抑えながら、迅速な外科的処置が可能になります。ここでは、精巣と卵巣の迅速な切除のためのプロトコルを詳述し、研究者がこの手術を迅速かつ安全に実施できるようにするための適切な術後モニタリングを示します。また、この手術を行う際に外科医に解剖学的ランドマークを提供するために、性器や周囲の組織の視覚的な例も含まれています。

プロトコル

すべての動物実験は、UTSWのInstitutional Animal Care and Use Committee(APN#2019-102840)によって承認されました。

1.マウス精巣摘除術

1. 無菌作業場を準備し、必要な手術器具が滅菌され、すぐに利用できるようにします。げっ歯類の生存手術のための無菌慣行に従ってください。
2. 雄マウスの体重を記録し、施設のガイドラインに従って好ましい麻酔方法を投与します。このプロトコルでは、麻酔を維持するために2%イソフルランを精密気化器を介して送達しました。処置の前に、施設のガイドラインに従って鎮痛剤を投与してください。このプロトコルでは、1.0 mg/kg のブプレノルフィン SR と 5 mg/kg のメロキシカムを皮下投与しました。
3. マウスが麻酔下に入ったら、目の損傷、角膜の乾燥、または潰瘍の形成を避けるために、動物の目を潤滑性アイジェルで覆います。
4. 先に進む前に、つま先のつまみ反応テストを実行して、麻酔の適切な平面を確認してください。
5. 動物の手術部位を無菌のドレープ付き手術野に置く前に、手術部位を準備します。
   1. 次に、バリカンを使用してマウスの鼠径部と陰嚢部を剃ります。
      注:陰茎よりも上の下腹部を剃ると、手術中の視認性が向上します。
   2. 綿テープで留めたアプリケーターを使用して、動物の皮膚に脱毛クリーム( 材料表を参照)の薄層を塗布し、剃ったばかりの陰嚢とその周辺を覆います。30秒待ってから、きれいなガーゼでクリームを取り除きます。
   3. 70%エタノールに浸したガーゼスポンジを使用して、残っているクリームと髪の毛を拭き取ります。
      注:このステップの70%エタノールは、脱毛クリームの完全な除去を支援するためのものです。手術部位の防腐剤調製は、ステップ1.8で行われる。
6. マウスを手術部位に移し、手術中に動物の体温を維持するための熱源があることを確認します。動物を外科用ドレープの上に仰臥位に置き、柔らかい粘着テープを使用してマウスの足を外科用マットに接着します。
7. 精巣が腹部に上行する場合は、腹部を慎重に触診して精巣を下降させます。手袋をはめた手を使って、腹部を下向きに穏やかに転がします。
   注:この手術は、解剖スコープの下で行うか、倍率を上げるためにルーペを使用する方が簡単です。これを解剖スコープで行う場合は、マウスの陰嚢をスコープの視野の下に配置してください。ソフトテープを使用して、マウスの脚または腹部を術野に接着し、正しい位置に留まるようにすることができます。
8. ベタジンサージカルスクラブ(または同様の消毒皮膚製剤スクラブ)で皮膚をこすり、続いて70%アルコールスクラブを少なくとも3回こすり、適切な皮膚消毒を確実にします。.各スクラブについて、外側に向かって放射状にスクラブし、切開部位の中央が最初にスクラブされ、最後に剃られた手術領域の外側の境界がスクラブされる状態で終わります。
9. このとき、滅菌手術用手袋を着用してください。手順の次のステップでは、無菌技術を使用します。マウスを滅菌手術用ドレープで覆い、動物の上に小さな切開(手術部位に合うように約0.5〜1インチの正方形にカット)して、ドレープ素材で体を覆います。
10. 承認された施設の動物福祉ガイドラインに従って、外科用メスの刃または同様の器具を使用して、長さ約1cm〜1.5cmの陰嚢に腹側正中線切開を作成します。
11. 皮膚の切断された境界をつかみ、先端が鈍い器具を使用して、皮膚を下の組織から分離します。切開部の外側、上側、下側の境界でこれを行います。
12. スパチュラと鉗子を使用して皮膚の切開部を移動し、睾丸の1つの上の中心に睾丸を分離します。これが難しい場合は、1.11に戻って、さらにスキンを下のレイヤーから分離します。
13. 湾曲した鉗子を取り、睾丸の両側に置きます。睾丸を外在化するために穏やかな下向きの圧力をかけます。鉗子を使用して、睾丸の上にある薄くて透明な筋肉の層をつかみます。これがクレマスター筋です。正しい筋肉層の検証は、この層とその循環を観察し、その下の睾丸から独立して移動することによって行われます。
    注:正しい組織の識別は、その透明性と下にある組織から独立して移動する能力によって確認されます。
    1. 筋肉の頂点がつかまるまで、鉗子を使用して筋肉組織を操作します。これは最も低い部分で、精巣と精巣上体尾が下にあります。
14. 鉗子でクレマスター筋をつかみ、精巣と精巣上体からそっと離します。バンナススプリングハサミの小さなペアを使用して、その頂点にある最初の睾丸のクレマスター筋を通して0.5cmの切開を作成します。
15. 切断されたクレマスター筋の後端にロッククランプを配置します。幅の狭い止血剤またはロック式マイクロニードルホルダーを使用してください。組織をクランプしたら、マウスの側面に器具を静かに置き、次の手順で組織をクランプしたままにします。
16. 鉗子を使用して、ステップ1.14で行った切開の上端をつかみます。クレマスター筋の両端を引っ込めている間に、別の鉗子を使用して空洞の内側に到達し、睾丸をそっとつかみます。
    1. 筋肉の穴から外側に引っ張ります。手術野に傷のある血管や血液の兆候がないか注意してください。
    2. 精巣、精巣上体、付着した精索、および血管は、組織が適切に外在化されると明らかになります。
    3. 精巣上体および睾丸の尾側 - 背側端近くには、睾丸のクレマスター筋への付着の線維性点がある。外部化された組織を横方向に転がして、この挿入点を見つけます。これを切断して、筋肉への損傷を回避し、組織のさらなる分離と視覚化を可能にします。2組の鉗子を使用して、クランプと引き裂きのテクニックを実行します。
17. 鼠径部脂肪パッドから睾丸の周りの脂肪組織を探します。鉗子を使って脂肪パッドをつかみ、そっと引っ張って外装します。
    1. 脂肪パッドに沿って移動する血管を引っ張ると出血につながる可能性があるため、つかまないでください。
18. 精索、血管、および外部組織に近位にある残りの脂肪パッドを見つけ、一対の止血剤を使用してクランプします。遠位睾丸にわずかな張力をかけながら、止血クランプの遠位の精索と血管を焼灼します。
    1. 完了したら、焼灼された端の近位にあるクランプをゆっくりと解放し、出血の兆候を確認します。存在する場合は、この手順を繰り返します。一対の鉗子を使用して、焼灼される組織の遠位端に穏やかな張力を保持することが有用です。
19. 精索の切断された断端を体内に引き込みます。クレマスター筋の2つの切断端をつかみ、それらを一緒にします。組織の切り傷の大きさを評価し、4-0または5-0の吸収性縫合糸を使用して組織を閉じます。切開サイズに応じて、1本または2本の縫合糸が必要になります。縫合はさみを使用して縫合糸の端を0.5cmにトリミングします。
20. 陰嚢の反対側で手順1.13〜1.20を繰り返して、2番目の睾丸を取り除きます。
21. 皮膚の切開を閉じる準備をします。
    1. 両方の組織断端の良好な止血を確保します。止血が不十分な場合、手術野に出血が残ります。これが発生した場合は、出血を見つけて焼灼してください。これは、鈍器で組織をゆっくりと慎重に操作することで回避できます。
    2. 手術野に血液が見られる場合は、滅菌された綿の先端が付いたアプリケーターを使用して、その領域を乾燥させ、視覚化を改善します。注射器を使用して生理食塩水をその領域に滴下し、手術野から血液や体液を灌漑します。
22. 皮膚切開部の両側を一緒に引っ張って、閉じる準備をします。クレマスター切開部の縫合された端が皮膚切開部に突き出ていないことを確認してください。必要に応じて、縫合糸の端をさらにトリミングします。
23. スキンを閉じます。
    1. 創傷クリップを使用する場合は、鉗子を使用して皮膚を剥がし、下にある組織から引き離します。切開部の中央に1つの創傷クリップを置きます。皮膚がしっかりと切り取られていることを確認してください。切開がわずかに大きすぎて、1つの創傷クリップで十分に閉じることができない場合は、切開の上側と下側の部分に外科用皮膚接着剤を塗布することができます。
    2. 縫合糸を使用する場合は、下にある組織をつかむことなく、必要な数の縫合糸を皮膚に通します。このタイプの切開には、4-0の非吸収性縫合糸材料を使用して、2〜3回の単一の断続縫合糸が必要です。
24. 生理食塩水と滅菌された綿の先端付きアプリケーターで手術部位の周りの皮膚をやさしく洗浄し、乾燥した血液や残留消毒剤のスクラブを取り除きます。

2.マウス卵巣摘出術

1. 無菌作業場を準備し、必要な手術器具が滅菌され、すぐに利用できるようにします。げっ歯類の生存手術のための無菌慣行に従ってください。
2. 雌マウスの体重を記録し、施設のガイドラインに従って好ましい麻酔方法を投与します。このプロトコルでは、麻酔を維持するために2%イソフルランを精密気化器を介して送達しました。処置の前に、施設のガイドラインに従って鎮痛剤を投与してください。このプロトコルでは、1.0 mg/kg のブプレノルフィン SR と 5 mg/kg のメロキシカムを皮下投与しました。
3. 目の損傷、角膜の乾燥、または潰瘍の形成を避けるために、動物の目に潤滑アイジェルを投与します。手術中に動物の体温を維持するための熱源が利用可能であることを確認してください。つま先をつまむ反応をチェックして、麻酔の適切な平面を確保します。
4. 動物を手術野に置く前に、動物の手術部位を準備します。
   1. バリカンを使用して、動物の背中の背外側の毛をそっと剃ります。ヒップの上縁より上、胸郭の下縁より下の領域、およびこれらのランドマークの間の領域から脱毛します。
   2. 先端が綿のアプリケーターを使用して、動物の皮膚に脱毛クリームの層を塗り、剃ったばかりの領域を覆います。30秒待ってから、ガーゼでクリームを取り除き、残っている細い毛を取り除きます。
   3. 70%エタノールを染み込ませたガーゼスポンジを使用して、手術部位に残っているクリームと髪の毛を拭き取ります。
      注:このステップの70%エタノールは、脱毛クリームを完全に除去するのに役立ちます。手術部位の防腐剤調製は、ステップ2.5で行われる。
5. 手術野の横方向の位置(一度に1つの卵巣を切開するため)に動物を置き、熱源が利用可能であることを確認します。ベタジン外科用スクラブ(または同様の消毒皮膚製剤スクラブ)で手術領域をこすり、続いて70%アルコールで少なくとも3回こすり、適切な皮膚消毒を確実にします。.スクラブごとに、半径方向に向かって外側にスクラブし、切開部の中央が最初にスクラブされ、剃られた手術領域の外側の境界が最後にスクラブされます。
6. このとき、滅菌手術用手袋を着用してください。手順の次のステップでは、無菌技術を使用します。小さな切開をした外科用ドレープ(手術部位に合うようにドレープを約0.5〜1インチの正方形にカット)を動物の上に置き、体がドレープ素材で覆われるようにします。
7. マウスの股関節と肋骨の中間点を見つけて、外科的切開の理想的な場所を見つけます( 図2を参照)。鉗子で皮膚をつかみ、この位置で皮膚を1.0cm切開します。
8. 先端が鈍い器具(プローブ、外科用スパチュラ、または先端が鈍い止血剤)を使用して、皮膚を下の筋肉組織から分離します。切開部の外側、上側、下側の境界でこれを行います。
9. 腹部の背外側筋壁を見つけます。必要に応じて、皮膚と筋肉層の間にある脂肪組織を取り除きます。成熟したマウスでは、この脂肪組織がより顕著です。この脂肪組織をマウスの尾端に向かって移動させ、筋肉壁を露出させます。
   1. 脂肪組織は色によって腹壁と区別されます:脂肪組織は淡い白色に見え、より表面的ですが、腹壁はピンク色に見え、脂肪組織よりも深い位置にあります。
10. ラット歯鉗子で腹壁をつかみ、0.5cm切開します。
11. 1対の鉗子でこの切開の1つの境界をつかみ、2対目を使用して体腔内に到達し、卵巣、子宮角、および脂肪パッドを見つけます。これを筋肉壁の切開部からそっと引き抜き、筋肉を下にある組織から分離し、外部化します。子宮角と卵巣の間の移行を見つけます。
12. 潰して引き裂くテクニックを実行して卵巣を切断します。
    1. 1つのクランプを子宮角の遠位端に置き、2番目のクランプを最初のクランプのすぐ遠位に配置します。両方のクランプでしっかりと圧力をかけながら、より遠位のクランプを体から離し、それらの間の接続を引き裂きます。出血や組織の損傷を最小限に抑えるために、このプロセス中は近位クランプを静止させ、体から引き離さないように注意してください。
    2. または、焼灼を使用してください。鉗子または止血剤のペアを使用して、子宮角を目的の焼灼点のすぐ近位にクランプします。焼灼器具を使用して組織を切断します。
13. 近位クランプを静かにゆっくりと解放し、出血の兆候がないか確認します。
14. 組織の断端を体腔内に後退させます。腹壁をつかみ、ゆっくりと上に引っ張ります。組織の切り株を内側に押し込むと、出血の可能性が高まるため、しないでください。
15. 筋肉壁への切開の境界を見つけ、それらを一緒に持ってきて、縫合する準備をします。
16. 4-0の吸収性縫合糸材料を使用して、1〜2本の断続縫合糸を腹筋壁に挿入します。縫合はさみを使用して縫合糸の端を0.5cmにトリミングします。
17. 皮膚を自然な静止状態に戻してから、下にある組織や縫合糸の端をつかまないように注意しながら、皮膚を上向きに動かして切開部を閉じます。エバートされた皮膚に1〜2個の傷クリップを配置します。施設のガイドラインに基づいて、4-0の非吸収性縫合糸材料を使用して皮膚を閉じることもできます。
18. もう一方の卵巣を摘出するには、マウスの位置を切り替えて、もう一方の側面を上に向けています。マウスの位置を切り替えるときは、手順2.17で切り取られた傷口に過度の圧力をかけないように、優しくしてください。
19. こちら側で、手順2.5〜2.17を繰り返します。
20. 生理食塩水と滅菌された綿の先端付きアプリケーターで手術部位の周りの皮膚をやさしく洗浄し、乾燥した血液や残留消毒剤のスクラブを取り除きます。

3. 術後のケア

1. 施設のガイドラインに従って、術後最大72時間鎮痛薬を投与してください。使用した日付、時刻、麻酔薬、鎮痛剤をメモして、動物の外科的処置を記録します。ここでは、ブプレノルフィン徐放性とメロキシカムが術前に投与されます。
2. 動物の手術が完了したら、乾いたペーパータオルで裏打ちされた清潔なケージに移します。このケージの2/3を熱源の上に置き、ケージの残りの1/3は火から下ろします。麻酔から回復するまで、マウスをケージに一緒に入れないでください。
3. 動物がケージ内を自由に歩き回れるようにしてから、通常の動物用寝具のある清潔なケージに戻します。このとき、すべてのマウスが麻酔から回復していれば、マウスを一緒に収容することができます。
4. 手術後の最初の数日間は、湿った食べ物と水が簡単に手に入るようにしてください。ケージの底に湿らせた餌を置きます。マウスの手術部位を頻繁にチェックし、感染や出血の兆候がないか探します。
5. 手術後、マウスを単独で飼育するか、同じ処置を同時に受けた他の動物と一緒に飼育してください。手術から回復したマウスは、手術をしていないマウスと同じケージにいるため、危険をもたらす可能性があるため、避ける必要があります。
6. 卵巣摘出術を受け、背中の背外側にクリップが創傷しているマウスの場合、治癒の最初の週にマウスの創傷クリップがイグルーに引っ掛かる可能性を減らすために、ケージからげっ歯類のイグルーの生息地をすべて取り除きます。
7. 治癒時間の最初の72時間まで、12時間ごとに感染、痛み、または外科的合併症の兆候がないか動物を監視し続けます。
8. 手術後10〜14日で創傷クリップ除去ツールを使用して創傷クリップを取り外します。

結果

ここで紹介する手順は、C57BL/6Jバックグラウンドの1〜3か月齢のマウスで行われます。処置時の雄マウスの体重は16〜28g、雌マウスの体重は14〜24gであった。この手順は、離乳期から成体期までの多くの年齢のマウスに適用できるように最適化されています。

外科的精巣摘除術では、図1Aに示すように、腹側陰嚢の皮膚を1回切開します。両方の精巣を...

ディスカッション

精巣と卵巣の外科的切除により、制御されたホルモン欠乏下でマウスの生理学を研究することができます。この技術は、神経変性、ミネラル代謝、心血管、リプロダクティブヘルスなど、多くの科学分野にとって重要です15,16,17,18,19,20,21。

資料

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Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	10-000-692
Double -ended Micro Spatula	Fine Science Tools	10091-12
Galilean Loupes	Fine Science Tools	28050-30	Optional, can provide better clarity during procedure
Gauze Sponges, 4"x4"	Fisher Scientific	13-761-52
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
High Temp Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Using the fine tip attachment
Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13
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