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摘要

该协议演示了使用沿流体流动方向改变几何形状的微流体通道来产生拉伸应变（拉伸）以在3D胶原水凝胶（厚度<250μm）中对齐纤维。由此产生的对齐延伸几毫米，并受拉伸应变率的影响。

摘要

排列的胶原I（COL1）纤维引导肿瘤细胞运动，影响内皮细胞形态，控制干细胞分化，是心脏和肌肉骨骼组织的标志。为了研究细胞对 体外排列微环境的反应，已经开发了几种协议来生成具有定义纤维排列的COL1基质，包括磁性，机械，基于细胞和微流体方法。其中，微流体方法提供了先进的功能，例如精确控制流体流动和细胞微环境。然而，用于高级 体外 培养平台生成对齐COL1基质的微流体方法仅限于COL1纤维的薄"垫"（厚度<40μm），其延伸距离小于500μm，不利于3D细胞培养应用。在这里，我们提出了一种协议来制造3D COL1矩阵（厚度为130-250μm），该矩阵具有微流体装置中定义的纤维排列的毫米级区域。该平台提供先进的细胞培养功能，通过直接访问用于细胞培养的微工程基质来模拟结构化组织微环境。

引言

细胞驻留在称为细胞外基质（ECM）的复杂3D纤维网络中，其中大部分由结构蛋白I型胶原蛋白（COL1）组成1，2。ECM的生物物理特性为细胞提供指导线索，作为回应，细胞重塑ECM微结构3，4，5。这些相互的细胞-基质相互作用可以产生排列的COL1纤维结构域6，其促进肿瘤环境中的血管生成和细胞侵袭7，8，9并影响细胞形态10，11，12，极化13和分化14。排列的胶原纤维还可以促进伤口愈合15，在组织发育中起关键作用16，并有助于长距离细胞通讯17，18。因此，在体外复制天然COL1纤维微结构是开发结构化模型以研究细胞对对齐微环境的反应的重要一步。

微流控细胞培养系统已被确立为开发微生理系统（MPS）的首选技术19，20，21，22，23。利用有利的微尺度缩放效应，这些系统提供对流体流动的精确控制，支持机械力的受控引入，并定义微通道21，24，25，26，27内的生化微环境。MPS平台已被用于模拟组织特异性微环境并研究多器官相互作用28。同时，水凝胶已被广泛探索，以概括在体内观察到的ECM的3D力学和生物学影响29，30。 随着越来越重视将3D培养与微流体平台相结合，许多方法可以在微流体装置中结合COL1水凝胶31，32，33。然而，在微流体通道中对齐COL1水凝胶的方法仅限于<1mm宽的通道中的薄2D"垫"（厚度<40μm），在对齐的3D微环境中模拟细胞反应的潜力有限31，34，35，36。

为了在微流体系统中实现对齐的3D COL1水凝胶，已经表明，当自组装COL1溶液暴露于局部拉伸流（沿流向的速度变化）时，所得COL1水凝胶显示出与它们经历的拉伸应变率的大小成正比的纤维取向程度37，38.该协议中的微通道设计在两个方面是独一无二的;首先，分段设计将局部拉伸应变引入COL1解决方案，其次，其"两件式"结构允许用户对齐COL1光纤，然后拆卸通道以开放格式直接访问对齐的光纤。这种方法可以进一步用于开发模块化微流体平台，开发具有有序COL1矩阵的微生理系统。以下协议描述了制造分段微通道的过程，并详细介绍了使用这些通道来对齐牛 atelo COL1。该协议还提供了以开放孔形式在COL1上培养细胞的说明，并讨论了使用模块化磁性基础层向平台添加功能。

研究方案

1. 两件式通道和模块化平台底座的制造

注意:微流体通道由两部分构成 - 微流体通道"切口"，它是从规定厚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片上切割的剃刀，以及通道盖，可逆地粘合到切口并形成通道。通道被聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）框架包围，该框架将充当介质储液器（图1）。PMMA框架还可用于磁性锁存专用模块以增加功能。

  1. PDMS 板材的剃刀切割通道:
    注意:补充 图1中提供了此步骤的微流体通道设计。通道由五个段组成，每个段长 5 mm，宽度为 10 mm、5 mm、2.5 mm、1.25 mm 和 0.75 mm。以恒定流速（50-400μL·min−1）注射的胶原溶液的速度随着通道宽度的减小而沿通道局部增加以产生拉伸流。
    1. 将 250 μm 厚的 PDMS 片材安装在塑料载体板上，并使用工艺切割机以 0.5 mm 的刀片深度、1 cm·s−1 的速度和高力对微流体设计进行剃刀切割。
    2. 使用超声波浴，清洁微流体通道切口5分钟。用去离子（DI）水冲洗超声通道，并在100°C的清洁加热板上干燥5分钟。
    3. 将通道存放在干净的、有盖的培养皿中直至使用。
  2. 制造PDMS盖和表面钝化:
    注意:第 1.1 节中的通道切口需要一个盖子，该盖子可以放在其顶部以创建一个封闭的通道，可以将 COL1 溶液注入其中（补充图 1）。COL1 自行组装后，可以取下盖子。为了尽量减少通道中的COL1与盖结合的机会，使用牛血清白蛋白（BSA）对盖子进行钝化。提供了PDMS盖的模具设计。模具的厚度必须至少为 2 mm，并且占地面积应等于微流体通道切口的占地面积。在此协议中，模具占地面积为35 mm x 15 mm。
    1. 要准备模具，请将一张压敏胶 （PSA） 贴在 2.5 毫米厚的 PMMA 片上，然后激光切割所需的模具形状。
    2. 用湿的无绒湿巾清洁激光切割的PMMA模具，并从PSA薄膜上取下背衬。将模具连接到直径为 100 mm 的硅晶片 bt 上，用力向下压。
    3. 以 10:1 的比例制备 PDMS（碱:交联剂）。剧烈混合1分钟以确保适当混合，并在真空室中对混合物进行脱气以去除气泡。
    4. 将脱气的PDMS溶液倒入PMMA /硅模具中，并在100°C的加热板上固化20分钟。让模具冷却，去除固化的PDMS，并用剃须刀片修剪任何多余的部分。
      注:在执行以下所有步骤时，确保PDMS盖的硅晶圆朝上（平边）。
    5. 使用直径为 1 mm 的活检打孔创建对应于微流体通道末端的入口和出口孔。步骤 1.1 中的通道切口可用作引导孔位置的模板。
    6. 用异丙醇（IPA）超声处理盖子5分钟，用去离子水冲洗，用压缩空气源干燥，然后储存在干净的覆盖的培养皿中。将培养皿置于紫外线灭菌室（未盖子）中1分钟以灭菌。
    7. 盖上并转移到生物安全柜（BSC）。
    8. 将 300 μL 40 mg•mL-1 牛血清白蛋白 （BSA） 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中移液到 PDMS 盖上，并使用移液器吸头均匀地涂抹溶液。使用前放入4°C的冰箱至少4小时。
    9. 将盖子从冰箱中移入 BSC，用 1x PBS 清洗 5 次，让它们在空气中干燥 10 分钟。
      注意:PDMS 盖子涂上 BSA 后，可以在冰箱中存放长达 1 周。
  3. 盖玻片的戊二醛处理
    注意:用戊二醛对盖玻片进行功能化可将COL1共价键合到盖玻片上，并防止水凝胶脱落。
    1. 在玻璃烧杯中加入 1 mL APTES 到 49 mL 丙酮中制备 2% （v/v） 氨丙基三乙氧基硅烷 （APTES） 溶液。
    2. 将25%戊二醛溶液在去离子水中稀释至5%。为每个 24 mm x 50 mm 盖玻片制作 2 mL 溶液。对于 24 mm x 24 mm 或 22 mm x 22 mm 盖玻片，每种盖玻片均制成 1 mL 溶液。
    3. 使用IPA在浴超声仪中清洁盖玻片5分钟。用去离子水冲洗掉盖玻片上的 IPA。当盖玻片上可以看到一层光滑的水膜时，IPA 被完全冲洗。
    4. 在100°C下在热板上干燥盖玻片5分钟。 将干燥的盖玻片放入干净的培养皿中，确保它们不会重叠。
    5. 使用电晕放电棒，将盖玻片暴露在电晕放电中，每次 1 分钟。
      注意:此步骤应在通风良好的区域或化学罩中进行。
    6. 从培养皿中取出盖玻片，然后在电晕暴露后5分钟内浸入APTES溶液中10秒，确保盖玻片被淹没。
      注意:确保跟踪用等离子体处理的哪一侧，并保持朝上。
    7. 然后，将盖玻片浸入丙酮中10秒并用压缩空气干燥。将干燥的盖玻片放回培养皿中，处理过的面朝上。
      注意:对所有盖玻片重复步骤1.3.5-1.3.7。
    8. 将 1 mL 戊二醛溶液移液到每个盖玻片的表面上。尽可能多地覆盖表面，不要让溶液溢出盖玻片的边缘。如有必要，可以添加更多的戊二醛溶液。确保不要用移液器吸头划伤表面。
    9. 让盖玻片与溶液接触30分钟，然后用去离子水冲洗20秒。使用压缩空气干燥盖玻片，然后将它们放回培养皿中，等离子体处理的一面朝上。
      注意:盖玻片可以在室温（RT）下保存长达1周。
  4. 激光切割模块化磁性底座
    注:模块化磁性底座的设计见补充图1。模块化底座用作固定介质的井，也可用于磁性连接专用模块，如先前发表的作品22，37，38，39中所述。
    1. 使用适当的激光设置（例如通过次数和功率）从PMMA层中切出设计。
      注意: 应调整激光设置，以便磁体可以压在 PMMA 层中。每个激光器都是不同的，切割参数必须通过实验优化。对于 45 W 激光器，建议使用 100% 速度、100% 功率和 3 次走刀切割 2 mm 至 2 mm 厚的 PMMA。
    2. 使用肥皂和水清洗激光切割部件，以去除激光切割过程中的碎屑。
      注意: 请勿使用溶剂清洁激光切割部件。溶剂可能导致激光切割边缘微裂纹的扩展。
  5. 组装平台
    1. 用手将磁铁（直径 3/16，厚度 1/16 英寸）推入激光切割底座。可以使用软锤或螺丝刀端来帮助推动磁铁。磁体的厚度必须小于PMMA基座的厚度，以确保磁体与基座表面齐平。
      注意:磁铁允许用户通过连接附加模块向平台添加功能。
    2. 从 PSA 片上撕下背衬，将底座连接到经戊二醛处理的盖玻片上，功能化的一面朝上。
    3. 轻轻地将 PDMS 通道切口放入框架定义的空腔中。用宽尖镊子向下按压以去除气泡并确保保形接触。
    4. 将 BSA 处理的通道盖放在通道切口的顶部，BSA 侧朝下。确保流体入口和出口与通道对齐。
    5. 该装置已准备好进行COL1注入。

2. 将COL1溶液注入微通道并取下细胞培养应用的盖子

  1. 准备 COL1 溶液
    1. 将所有必需的试剂（COL1储备溶液[6mg·mL−1]，超纯水，10x PBS，0.1M NaOH）放在生物安全柜中的冰上。
    2. 按如下方式计算试剂体积
      figure-protocol-3563
      figure-protocol-3657
      figure-protocol-3749
      figure-protocol-3841
      注意:因此，要从 6 mg·mL−1 储备液中制备 1 mL 的 2.5 mg·mL−1 中和胶原蛋白，请加入 416.67 μL 胶原蛋白、429.16 μL 去离子水、100 μL 10x PBS 和 54.16 μL 0.1 M NaOH，最终 pH 值为 7。加入 20 μL 0.1 M NaOH 以达到 9.0 的 pH 值。
    3. 按以下顺序将试剂加入空的 5 mL 小瓶中:i） COL1 储备液，ii） 去离子水，iii） 10x PBS，iv） 0.1 M NaOH。
      注意:使用置换式移液器处理COL1溶液。如果使用常规移液器，可能会出现明显的样品损失，从而导致最终溶液浓度的波动。
    4. 将溶液的pH值提高到所需的pH值（通常在7-9之间）。
  2. 注入COL1溶液
    1. 将注射泵、冷冻无菌注射器、冷冻中和 COL1 溶液和无菌 20 G 90° 角尖端鲁尔锁针放入生物安全柜中。将COL1溶液装入注射器中，注意避免引入气泡。
    2. 将 90° 20 G 针尖连接到注射器上，将注射器装入注射泵，针头朝下，然后用 COL1 溶液灌注针头。
    3. 将注射泵设置为所需的流速，介于 50-2，000 μL/min 之间。
    4. 将准备好的PDMS通道（第1部分）放在实验室千斤顶上，并与针头水平。
    5. 将针头插入PDMS通道的入口端口（宽边）。注入通道，直到~30 μL的COL1液滴聚集在出口侧。
    6. 放下实验室插孔，轻轻地将针头与新填充的通道分开。
    7. 重复步骤2.2.5-2.2.9，直到所有通道都充满COL1溶液。
    8. 将填充的通道加载到培养皿中，同时用干净的无绒湿巾浸有去离子水，以防止新形成的COL1凝胶脱水。
    9. 盖上培养皿，并将装载的通道置于培养箱（37°C，95%湿度）中2小时，然后剥离步骤。
  3. 剥离和培养基平衡
    1. 通过使用镊子提起PDMS盖来暴露聚合的COL1凝胶。BSA处理可防止COL1附着在盖子上。
    2. 向孔中加入 650 μL EGM。
    3. 将设备留在培养箱（37°C，95%湿度）中至少4小时以平衡凝胶和培养基。接种细胞前更换培养基
  4. 接种细胞
    1. 将温热的 0.25% 胰蛋白酶和培养基以及所需数量的 5 mL 和 10 mL 移液器放入生物安全柜中。
    2. 在37°C，95%湿度下将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养至80%汇合度。在显微镜下检查汇合度后，将含有HUVEC的组织培养瓶放入平衡计分卡中。
    3. 将培养基丢弃在T25烧瓶中，并用1x PBS洗涤细胞2倍。向烧瓶中加入1mL胰蛋白酶，并将其置于培养箱（37°C，95%湿度）中3分钟。
    4. 3分钟后在显微镜下检查烧瓶，以确保细胞与表面完全分离。
    5. 向烧瓶中加入 3 mL EGM（含血清）以中和胰蛋白酶。接下来，使用 5 mL 移液管将细胞溶液转移到 15 mL 锥形管中。将含有细胞的锥形管以150× g 离心5分钟。
    6. 将锥形管放入生物安全柜中，在不干扰细胞沉淀的情况下丢弃上清液。将细胞重悬于1 mL新鲜培养基中。
    7. 在 1 mL 锥形管中加入并混合 15 μL 台盼蓝和 15 μL 重悬细胞溶液。
    8. 在细胞计数载玻片的两侧注入台盼蓝和细胞溶液，然后将载玻片插入细胞计数装置中。
    9. 根据从细胞计数装置获得的细胞浓度，将内皮生长培养基中的细胞溶液稀释至所需浓度。
      注意:如果在 1 mL 培养基中稀释，在 80% 汇合度下使用 HUVEC 的 T25 烧瓶将产生 ~750，000 个细胞·ml−1 。待接种的细胞悬液的体积计算为培养表面的面积×细胞密度/细胞悬液浓度。示例:要在 35 mm x 15 mm 孔中接种 20，000 个细胞·cm−2 ，需要 ~140 μL 细胞悬液。
    10. 吸出工程COL1基质上的培养基。
    11. 将所需体积的细胞溶液添加到COL1底物上，并在成像前让细胞沉淀至少4小时。
  5. 标记细胞核和细胞骨架
    1. 从细胞中吸出培养基，并用 1x PBS 洗涤 3 次，每次洗涤 500 μL。在室温下用4%多聚甲醛覆盖细胞层15分钟。
    2. 吸出多聚甲醛并用 1x PBS 吐温-20 洗涤 5 分钟。
    3. 使用 500 μL PBS 中的 0.1% Triton-X 溶液透化细胞膜 15 分钟。用 1x PBS 吐温-20 洗涤 5 分钟。
    4. 在室温下用 500 μL 4% BSA 在 PBS 中封闭非特异性结合位点 30 分钟。
    5. 在 4% BSA（1 μL 原液在 400 μL BSA 中）中稀释鬼笔环肽-肌动蛋白荧光标记溶液。
    6. 吸出BSA溶液，将鬼笔环肽溶液添加到细胞中，并在室温下等待30分钟。
    7. 用 4% BSA（1 μL 在 500 μL 中稀释核染色剂），吸出鬼笔环肽，加入工作核染色溶液，并在室温下等待 15 分钟。
    8. 吸出核染色工作溶液，用PBS Tween-20 3x洗涤5分钟，并在成像前用1x PBS替换。
    9. 使用带有40倍镜头的FITC通道（例如491 nm / em 516 nm）和DAPI通道（例如360 nm / em 460 nm）的落射荧光显微镜进行图像。使用488 nm激光线（15%功率）和40倍水浸物镜在反射模式下使用激光扫描共聚焦对胶原蛋白进行成像。

结果

当自组装COL1解流过横截面积减小的通道时，COL1解的流速（v x）沿两段之间的收缩长度（∂x）局部增加一个量级∂v x，导致拉伸应变率（ε̇），其中ε̇ = ∂v x/∂x。拉伸应变率可以通过流体速度计算，流体速度是使用粒子图像测速法（PIV）测量的，如图2所示。

先前，已经表明局部拉伸应变促进长距离COL1纤维排列37...

讨论

已经使用磁性方法、机械应变的直接应用和微流体技术描述了生成具有排列纤维的 COL1 矩阵的协议47。微流体方法通常用于创建微生理系统，因为它们具有明确定义的流动和运输特性，可以精确控制生化微环境。由于排列的COL1纤维在病理生理过程中（如伤口愈合，肿瘤细胞侵袭和组织发育）提供了关键的指导性线索，因此在微流体系统中生成排列的COL1基质是朝着开发生物学相关...

披露声明

所有作者均声明没有竞争利益。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的部分支持，奖励号为R21GM143658，美国国家科学基金会的资助号为2150798。内容完全由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing TipJensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated MagnetKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%Signa Aldrich179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATERElectro-Technic Products12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Clear cast acrylic sheetMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus TestedVWR45000-666
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CT-FIRE softwareLOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mLLonzaCC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mLVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A DurometerMcMaster-Carr87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cellsThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IsopropanolFisher ScientificA4154
Laser cutterFull Spectrum20x12 H-series
Microfluidics Syringe pumpNew Era Syringe PumpsNE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000EGilsonFD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4VWR70011044.00
PBS pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100Alfa AesarJ63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer SlipRestek22766.00
Silicon waferUniversity wafer452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00

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