Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

Resumen

Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

Resumen

Las fibras alineadas de colágeno I (COL1) guían la motilidad de las células tumorales, influyen en la morfología de las células endoteliales, controlan la diferenciación de las células madre y son un sello distintivo de los tejidos cardíacos y musculoesqueléticos. Para estudiar la respuesta celular a microambientes alineados in vitro, se han desarrollado varios protocolos para generar matrices COL1 con alineación de fibra definida, incluidos métodos magnéticos, mecánicos, basados en células y microfluídicos. De estos, los enfoques microfluídicos ofrecen capacidades avanzadas, como un control preciso sobre los flujos de fluidos y el microambiente celular. Sin embargo, los enfoques microfluídicos para generar matrices COL1 alineadas para plataformas avanzadas de cultivo in vitro se han limitado a "esteras" delgadas (<40 μm de espesor) de fibras COL1 que se extienden a distancias inferiores a 500 μm y no son propicias para aplicaciones de cultivo celular 3D. Aquí, presentamos un protocolo para fabricar matrices 3D COL1 (130-250 μm de espesor) con regiones de escala milimétrica de alineación de fibra definida en un dispositivo microfluídico. Esta plataforma proporciona capacidades avanzadas de cultivo celular para modelar microambientes de tejidos estructurados al proporcionar acceso directo a la matriz de microingeniería para el cultivo celular.

Introducción

Las células residen en una compleja red fibrosa 3D llamada matriz extracelular (MEC), la mayor parte de la cual está compuesta por la proteína estructural colágeno tipo I (COL1)^1,2. Las propiedades biofísicas de la ECM proporcionan señales de orientación a las células y, en respuesta, las células remodelan la microarquitectura de la ECM ^3,4,5. Estas interacciones recíprocas célula-matriz pueden dar lugar a dominios de fibra COL1 alineados⁶ que promueven la angiogénesis y l....

Protocolo

1. Fabricación del canal de dos piezas y la base de la plataforma modular

NOTA: El canal microfluídico se construye utilizando dos partes: el "recorte" del canal microfluídico, que es una cuchilla cortada de una lámina de polidimetilsiloxano (PDMS) de espesor definido, y la cubierta del canal, que se une reversiblemente al corte y forma el canal. El canal está rodeado por un marco de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) que actuará como un depósito de medios (Figura 1). El marco de PMMA también se puede utilizar para enganchar magnéticamente módulos especializados para mayor funcionalidad.

....

Resultados

Cuando una solución COL1 autoensamblable fluye a través de un canal con área de sección transversal decreciente, la velocidad de flujo (v x) de la solución COL1 aumenta localmente en una magnitud, ∂v x, a lo largo de la longitud de la constricción entre los dos segmentos (∂x), lo que resulta en una velocidad de deformación extensional (ε̇) donde ε̇ = ∂v x / ∂_x. La velocidad de deformación extensional se puede calcular a partir de la velocidad del fluido, que se mide ut.......

Discusión

Los protocolos para generar matrices COL1 con fibras alineadas han sido descritos utilizando métodos magnéticos, la aplicación directa de deformación mecánica y técnicas microfluídicas⁴⁷. Los enfoques microfluídicos se utilizan comúnmente para crear sistemas microfisiológicos debido a sus características de flujo y transporte bien definidas, que permiten un control preciso sobre el microambiente bioquímico. Dado que las fibras COL1 alineadas proporcionan señales instructivas clave dur.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested	VWR	45000-666
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE software	LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laser cutter	Full Spectrum	20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump	New Era Syringe Pumps	NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E	Gilson	FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Silicon wafer	University wafer	452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00