基于免疫染色的红细胞蛋白动态改变检测

摘要

捕获去核红细胞蛋白质活化的动态变化带来了方法学挑战，例如保留急性刺激的动态变化以供以后评估。所提出的方案描述了样品制备和染色技术，这些技术能够保存和分析相关的蛋白质变化和随后的检测。

摘要

红细胞（RBC）蛋白的抗体标记是一种常用的半定量方法，用于检测总蛋白质含量的变化或蛋白质活化状态的急性改变。它有助于评估红细胞治疗，表征某些疾病状态的差异以及描述细胞一致性。检测急性改变的蛋白质活化（例如，通过机械转导）需要足够的样品制备，以保留其他暂时的蛋白质修饰。基本原理包括固定所需红细胞蛋白的靶结合位点，以实现特异性一抗的初始结合。对样品进行进一步处理，以保证二抗与相应一抗结合的最佳条件。非荧光二抗的选择需要额外的处理，包括生物素-亲和素偶联和应用3,3-二氨基联苯胺-四盐酸盐（DAB）进行染色，需要在显微镜下实时控制染色，以便及时停止氧化，从而停止染色强度。对于染色强度检测，使用标准光学显微镜拍摄图像。在该方案的修改中，可以应用荧光素偶联的二抗，其优点是不需要进一步的开发步骤。然而，该过程需要将荧光物镜连接到显微镜上进行染色检测。鉴于这些方法的半定量性质，必须提供几种对照染色剂来解释非特异性抗体反应和背景信号。在这里，我们介绍了染色方案和相应的分析过程，以比较和讨论不同染色技术各自的结果和优势。

引言

红细胞 （RBC） 在心血管系统中穿行 70 至 140 天，平均红细胞年龄约为 115 天 ^1,2。衰老或受损的红细胞通过噬红细胞作用从循环中去除，这是一种由巨噬细胞驱动的高效清除过程³。这些细胞的预定寿命是在分化和成熟过程中放弃细胞器（包括细胞核、线粒体和核糖体）的结果^之一4。因此，循环红细胞缺乏翻译机制，排除了新蛋白质的合成³。因此，对现有蛋白质的动态翻译后修饰代表了响应作用于红细胞的细胞外^和细胞内应激源的急性生化调节的唯一可行机制5。

机械力似乎是导致红细胞内生化途径激活或调节的主要细胞外线索。在红细胞膜⁶中发现机械敏感蛋白Piezo1激发了研究^{这些细胞中}机械激活信号传导的几条研究线7。例如，最近的进展表明，红细胞的物理性质受到蛋白质⁸的急性和动态变化的积极调节，其中包括翻译后磷酸化和泛素化⁹。由于这些正常修饰^{在某些疾病中}有所不....

研究方案

此处描述的协议符合《赫尔辛基宣言》，并已获得德国科隆体育大学（2013 年 9 月 16 日）和格里菲斯大学（2019/808）伦理委员会的批准。对志愿者进行筛选以确保没有相关病理，并提供书面知情同意书。

1. 使用免疫组织化学方案对红细胞蛋白进行染色

注意： 材料表中提供了所需化学品和材料的详细清单。以下部分描述了所需溶液的制备，然后详细介绍了免疫组织化学方案（图1）。

图 1：在磷酸化位点 1177 对 RBC-NOS 进行免疫组织化学和免疫荧光染色所需的各个步骤示意图。 介绍了从溶液制备和血液采样到基于抗体的检测和可视化的方案的典型工作流程。

结果

所提出的方案描述了促进检测红细胞蛋白急性改变的方法，并在一种众所周知的机械敏感蛋白质改变上进行了测试：丝氨酸1177残基处红细胞-NOS的磷酸化。从健康志愿者那里获得全血，随后分成两个单独的等分试样。将给定的血液样品暴露于生理量级（5 Pa）的机械剪切应力下300秒，先前显示其在丝氨酸1177¹⁴处引起RBC-NOS磷酸化。在停止机械剪切暴露后，立即将血液样品固定在多聚.......

讨论

最近的文献高度表明，RBC-NOS蛋白对于调节RBC变形性至关重要15,22,23^，这反过来又促进了它们通过狭窄的毛细血管²⁴。蛋白质活性高度依赖于翻译后蛋白质修饰，特别是某些残基的磷酸化¹⁸。感兴趣的焦点在于磷酸化位点1177，其与RBC-NOS蛋白²³的活化有关。这种蛋白质的改变已?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate	Sigma/Merck	D5637	DAB
Ammoniumchloride	Merck /Millipore	101145	NH4Cl
Centrifuge 5427 R	Eppendorf	5409000010
Coverslips	VWR	631-0147
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate	Merck /Millipore	106580	Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes	VWR	612-6803
Entellan	Merck /Millipore	107961	rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK)	Hofmann	642
Glucose-Oxidase	Sigma/Merck	G2133
Grease pencil	Dako	S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase	Sigma/Merck	E-2886	HRP
Hydrochloric acid	Merck /Millipore	109057	HCl
Hydrogen peroxide, 30%	Merck /Millipore	107203	H2O2
ImageJ Software	Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA)	RR Mechatronics		Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol	Merck /Millipore	106009
Microscope slides	VWR	630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate	Sigma/Merck	N4882	NiSO4.6H2O
Normal Goat serum	Agilent/DAKO	X0907	NGS
Paraformaldehyde	Merck /Millipore	818715	PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2	VWR	613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)	Merck/Millipore	07-428-I	Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml	Eppendorf	30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit	Agilent/DAKO	E0432	Secondary Antibody
Skim milk powder	Bio-Rad	170-6404
Sodium chloride	Merck /Millipore	106404	NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck /Millipore	106346	NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M	Merck /Millipore	150706	NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Merck /Millipore	108382	Tris
Trypsin	Sigma/Merck	T7409
Tween20	Merck /Millipore	822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F	Merck /Millipore	WHA1825047
Xylol	VWR Chemicals	2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate	Merck /Millipore	14431-43-7