Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Riepilogo

Catturare i cambiamenti dinamici nell'attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l'analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.

Abstract

La marcatura anticorpale delle proteine dei globuli rossi (RBC) è un metodo semi-quantitativo comunemente usato per rilevare cambiamenti nel contenuto proteico complessivo o alterazioni acute negli stati di attivazione delle proteine. Facilita la valutazione dei trattamenti con globuli rossi, la caratterizzazione delle differenze in alcuni stati patologici e la descrizione delle coerenze cellulari. Il rilevamento di un'attivazione proteica acutamente alterata (ad esempio, attraverso la meccanotrasduzione) richiede un'adeguata preparazione del campione per preservare modificazioni proteiche altrimenti temporanee. Il principio di base include l'immobilizzazione dei siti di legame bersaglio delle proteine RBC desiderate per consentire il legame iniziale di specifici anticorpi primari. Il campione viene ulteriormente elaborato per garantire condizioni ottimali per il legame dell'anticorpo secondario all'anticorpo primario corrispondente. La selezione di anticorpi secondari non fluorescenti richiede un trattamento aggiuntivo, compreso l'accoppiamento biotina-avidina e l'applicazione di 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per sviluppare la colorazione, che deve essere controllata in tempo reale al microscopio per fermare l'ossidazione, e quindi l'intensità della colorazione, in tempo. Per il rilevamento dell'intensità della colorazione, le immagini vengono scattate utilizzando un microscopio ottico standard. In una modifica di questo protocollo, può essere applicato invece un anticorpo secondario coniugato con fluoresceina, che ha il vantaggio che non è necessaria alcuna ulteriore fase di sviluppo. Questa procedura, tuttavia, richiede un obiettivo di fluorescenza collegato a un microscopio per il rilevamento della colorazione. Data la natura semi-quantitativa di questi metodi, è imperativo fornire diverse colorazioni di controllo per tenere conto delle reazioni anticorpali non specifiche e dei segnali di fondo. Qui, presentiamo sia i protocolli di colorazione che i corrispondenti processi analitici per confrontare e discutere i rispettivi risultati e vantaggi delle diverse tecniche di colorazione.

Introduzione

I globuli rossi (RBC) attraversano il sistema cardiovascolare per 70-140 giorni, con un'età media dei globuli rossi di circa 115 giorni ^1,2. I globuli rossi senescenti o danneggiati vengono rimossi dalla circolazione mediante eritrofagocitosi, un efficiente processo di compensazione guidato dai macrofagi³. La durata della vita predeterminata di queste cellule è una conseguenza della resa degli organelli cellulari, incluso il nucleo, i mitocondri e i ribosomi, durante la differenziazione e la maturazione⁴. Pertanto, i globuli rossi circolanti sono privi di un meccanismo traslazionale, precludendo la sintesi di nuove proteine³. Ne consegue che le modificazioni dinamiche post-traduzionali delle proteine esistenti rappresentano l'unico meccanismo praticabile di regolazione biochimica acuta in risposta a fattori di stress extracellulari e intracellulari che agiscono sui globuli rossi⁵.

Le forze meccaniche sembrano essere i principali segnali extracellulari che causano l'attivazione o la modulazione dei percorsi biochimici all'interno dei globuli rossi. La scoperta della proteina meccanosensibile, Piezo1, nelle membrane RBC⁶ ha ispirato diverse linee di ricerca che studiano la segnalazione attivata meccanicamente in queste cellule⁷. Ad esempio, recenti progressi hanno dimostrato che le proprietà fisiche dei globuli rossi sono attivamente regolate da cambiamenti acuti e dinamici delle proteine⁸, che includono la fosforilazione post-traduzionale e l'ubiquitinazione⁹. Poiché queste normali modificazioni differiscono in alcune malattie 9,10,11, sembra essere di interesse scientifico e clinico determinare lo stato di attivazione delle proteine RBC^, in particolare in relazione ai processi meccanobiologici.

La determinazione di cambiamenti acuti negli stati di attivazione della proteina RBC pone alcune sfide metodologiche. Ad esempio, la conservazione dei campioni di RBC per analisi successive richiede la conservazione delle proteine RBC modificate, poiché le modifiche post-traduzionali non sono durevoli. Inoltre, i metodi classici di rilevamento delle proteine (ad esempio, western blotting) sono notoriamente difficili da standardizzare nei globuli rossi a causa della bassa abbondanza di proteine rispetto all'emoglobina, che rappresenta ~ 98% del contenuto proteico in queste cellule¹². Pertanto, la colorazione basata su anticorpi di globuli rossi conservati chimicamente è stato il metodo di scelta quando si studiano le modificazioni acute di importanti proteine RBC, come l'isoforma specifica dei globuli rossi dell'ossido nitrico sintasi (RBC-NOS)^13,14. È stato dimostrato che RBC-NOS produce enzimaticamente ossido nitrico (NO), che sembra indispensabile per le proprietà essenziali dei globuli rossi, inclusa la deformabilità dei globuli rossi^15,16,17. Le modificazioni post-traduzionali di RBC-NOS regolano l'attività enzimatica catalitica, con la fosforilazione del residuo di serina 1177 descritta per aumentare l'attività enzimatica, mentre la fosforilazione dei residui serina 114 o treonina 495 è stata collegata a una diminuzione dell'attività RBC-NOS^18,19.

Collettivamente, le modifiche temporanee delle proteine RBC contribuiscono a importanti funzioni cellulari e i protocolli standardizzati che consentono il rilevamento di queste proteine modificate sono di alto valore. Qui, presentiamo due protocolli distinti che sfruttano anticorpi specifici per facilitare la rilevazione dell'attivazione della proteina RBC-NOS e discutiamo le raccomandazioni per l'analisi e l'interpretazione dei dati.

Le prestazioni dei protocolli descritti sono state valutate misurando l'aumento ben riportato della fosforilazione di RBC-NOS al residuo di serina 1177 in risposta a forze meccaniche riflettenti quelle che si verificano all'interno del sistema vascolaristico umano (5 Pa).

Protocollo

I protocolli qui descritti sono in linea con la Dichiarazione di Helsinki e sono stati approvati dai comitati etici dell'Università tedesca dello sport di Colonia (16/09/2013) e dell'Università Griffith (2019/808). I volontari sono stati sottoposti a screening per garantire l'assenza di patologie rilevanti e hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Colorazione delle proteine RBC utilizzando protocolli immunoistochimici

NOTA: un elenco dettagliato delle sostanze chimiche e dei materiali richiesti è fornito nella tabella dei materiali. Le sezioni seguenti descrivono la preparazione delle soluzioni richieste, seguite da una descrizione dettagliata del protocollo immunoistochimico (Figura 1).

Figura 1: Schema delle singole fasi necessarie per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza di RBC-NOS nel sito di fosforilazione 1177. Viene presentato un flusso di lavoro tipico dei protocolli presentati che si estende dalla preparazione della soluzione e dal prelievo di sangue al rilevamento e alla visualizzazione basati sugli anticorpi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Raccolta del campione di sangue
   1. Ottenere campioni di sangue (10 ml di sangue intero) da sette maschi sani. I volontari erano individui sani privi di malattie cardiovascolari, ematologiche, neurologiche, endocrine o metaboliche. I volontari erano anche non fumatori.
   2. Raccogliere il sangue usando un ago sterile e una siringa da una vena prominente nella regione antecubitale dell'avambraccio e trasferirlo immediatamente in tubi rivestiti con uno dei seguenti anticoagulanti: eparina di sodio (per immunoistochimica) o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; per l'etichettatura fluorescente).
   3. Esporre i campioni di sangue anticoagulati a forze meccaniche controllate con precisione utilizzando un sistema di cesoiatura tipo Couette, come^{descritto prima 7,20}.
      1. L'apparato di taglio comprende una coppa girevole e un bob stazionario, separati da uno spazio di 300 μm. Trasferire il campione di sangue nello spazio, il che fa sì che la velocità di rotazione controllabile con precisione della tazza eserciti forze meccaniche ben controllate sul campione. I dati rappresentativi qui presentati sono stati prodotti applicando forze meccaniche che riflettono quelle che si verificano all'interno del sistema vascolare umano (5 Pa) per durate prolungate (300 s).
2. Preparazione delle soluzioni necessarie per l'immunocolorazione
   1. Preparare le soluzioni come nella Tabella 1. Le soluzioni possono essere preparate prima di eseguire la procedura di immunocolorazione e conservate a una determinata temperatura fino al momento del bisogno.
      NOTA: la durata di conservazione può variare tra le sostanze chimiche. Controllare la scheda di sicurezza dei materiali.
3. Preparazione del campione
   1. Processare il sangue intero immediatamente dopo la sospensione o il trattamento sperimentale (ove applicabile; ad esempio, stimolo meccanico nei nostri campioni; vedere il punto 1.1.3) per essere in grado di rilevare effetti di breve durata, ad esempio dopo l'applicazione di stress da taglio, l'esercizio fisico, l'esposizione all'ipossia di breve durata, ecc.
   2. Eseguire la fissazione della proteina RBC usando formaldeide come segue: diluire il sangue intero in un rapporto di 1: 2 in soluzione di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare il campione a 132 x g per 3 minuti a RT e rimuovere con attenzione il surnatante mediante pipettaggio.
   3. Risospendere il pellet RBC in due volumi di soluzione salina tamponata fosfato 0,1 mol/L (diluizione 1:3) e incubare per 5 minuti a RT. Ripetere la centrifugazione come descritto sopra e rimuovere il surnatante, che dovrebbe essere chiaro, mediante pipettaggio. Risospendere il pellet RBC in un volume di 0,1 mol/L PBS (diluizione 1:2).
   4. Preparare strisci di sangue come segue: etichettare un vetrino da microscopio con l'ID del campione, l'anticorpo applicato, ecc. utilizzando una penna resistente all'alcool (ad esempio, matita). Quindi, aggiungere 10 μL della soluzione RBC preparata proprio sopra il campo dell'etichetta.
   5. Posizionare un secondo vetrino sul campione con un angolo di circa 45° e disperdere uniformemente il campione lungo il vetrino. Fissare a caldo la slitta su un bruciatore Bunsen facendo passare il campione sopra il bruciatore con movimento costante per 5-7 s.
      NOTA: Si consiglia di asciugare all'aria i campioni prima del fissaggio a caldo. I campioni possono essere conservati in RT fino alla colorazione (Figura 2).
4. Colorazione immunoistochimica
   1. Contrassegnare due aree su ciascun vetrino: un'area di test in cui i globuli rossi sono incubati con il rispettivo anticorpo primario e secondario e un'area di controllo in cui l'anticorpo primario viene sostituito da una soluzione di controllo. Quest'area funge da controllo interno del saggio per determinare il segnale di fondo dei globuli rossi.
   2. Preparare le soluzioni prima o durante la procedura, come da tabella 2. È necessario un volume di 300 μL per area di prova e 200 μL per area di controllo.
      NOTA: È importante notare che queste procedure di colorazione basate su anticorpi producono dati semi-quantitativi, piuttosto che quantitativi. Pertanto, per garantire che si possano trarre conclusioni significative dai dati prodotti, sono assolutamente necessari campioni di controllo appropriati (cioè per fornire un punto di riferimento per i cambiamenti relativi valutati nell'attivazione delle proteine).
   3. Per la digestione della tripsina, scongelare lo 0,1% di tripsina ed equilibrare a RT. Segnare due aree su ciascun vetrino usando una matita grassa: un'area di prova (2/3 del vetrino) e un'area di controllo (1/3 del vetrino). Applicare con cautela la soluzione salina tris-buffered (TBS) utilizzando pipette transfer per lavare le aree del campione. Lasciare riposare il TBS per 30 secondi e poi versarlo. Ripetere la fase di lavaggio.
      NOTA: aggiungere le seguenti soluzioni sia al controllo che all'area di test, se non diversamente descritto. Le aree devono essere sufficientemente coperte con la rispettiva soluzione. Applicare le soluzioni utilizzando pipette transfer monouso e cambiare pipette dopo ogni soluzione.
   4. Aggiungere tripsina allo 0,1%, coprire i vetrini utilizzando una camera di incubazione appositamente costruita con coperchio o foglio di alluminio e incubare per 30 minuti a 37 °C in un'incubatrice. Dopo l'incubazione, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo acqua di rubinetto. Versare la soluzione. Lavare entrambe le aree 3 volte con TBS, come descritto sopra.
   5. Per bloccare l'attivazione della perossidasi, aggiungere una soluzione di metanolo e incubare per 30 minuti su RT. Coprire le diapositive durante quel periodo. Versare la soluzione.
      NOTA: Per la rilevazione con immunofluorescenza (paragrafo 2), questo passaggio può essere omesso, dato che il blocco delle perossidasi endogene serve a prevenire il segnale artefattuale causato dalla rilevazione con perossidasi di rafano (HRP) e 3,3′-Diaminobenzidina idrato (DAB).
   6. Lavare entrambe le aree 3 volte con TBS, come descritto al punto 1.4.3. Aggiungere una soluzione di latte scremato al 3% e incubare per 30 minuti a RT per bloccare. Versare la soluzione. Non lavare dopo.
   7. Aggiungere l'anticorpo primario (AB) solo all'area di test. Aggiungere la soluzione di controllo AB (vedere Tabella 2) all'area di controllo. Incubare i campioni a 4 °C durante la notte. Coprire le diapositive durante quel periodo per evitare l'asciugatura.
      NOTA: evitare di trasferire le soluzioni dal test all'area di controllo, poiché ciò influenzerebbe i valori di controllo.
   8. Versare la soluzione anticorpale. Lavare entrambe le aree 3 volte con TBS, come descritto al punto 1.4.3.
   9. Eseguire un passaggio di blocco per impedire l'associazione non specifica. Aggiungere il 3% di siero di capra normale e incubare per 30 minuti a RT. Versare la soluzione.
   10. Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria e incubare per 30 minuti a RT. Versare la soluzione anticorpale. Lavare le aree 3 volte con TBS, come descritto al punto 1.4.3.
5. Sviluppo di colorazione e copertura
   1. Effettuare la reazione HRP accoppiata ad avidina (vedere diluizione nella Tabella 2) aggiungendo una soluzione diluita di avidina-perossidasi e incubando per 30 minuti a RT. Versare la soluzione.
   2. Preparare la miscela DAB per sviluppare l'immunocolorazione prima dell'uso, come da Tabella 3.
      ATTENZIONE: DAB è pericoloso. Considerare le indicazioni di pericolo H341 (sospettato di causare difetti genetici) e H350 (può causare il cancro). Considerare i seguenti consigli di prudenza: P201, P202, P280, P308+P313, P405 e P501.
   3. Eseguire la colorazione di controllo DAB come segue: raccogliere la soluzione HRP dal punto 1.5.1 da un vetrino e miscelare con un piccolo volume (ad esempio, 1 ml) di soluzione DAB preparata in una provetta da centrifuga separata prima della colorazione. La miscela dovrebbe sviluppare un colore marrone / grigio.
   4. Posizionare i vetrini al microscopio (ingrandimento di almeno 200x) e aggiungere la soluzione DAB a entrambe le aree. Monitorare continuamente la colorazione dei globuli rossi e interrompere la colorazione rimuovendo la soluzione DAB con una pipetta usa e getta prima che lo sfondo inizi a colorarsi. Per la colorazione con serina 1177 RBC-NOS, il tempo di incubazione DAB è di circa 17 minuti.
   5. Eseguire la disidratazione del campione. Posizionare i vetrini in una griglia di vetro e immergere per 5 s ciascuno in soluzioni di etanolo di varie diluizioni, iniziando con il 70%, seguito dal 96% e poi dal 100% e infine in xilolo. Rimuovere i vetrini dal rack e posizionarli su un fazzoletto, con globuli rossi nella parte superiore per assorbire il liquido in eccesso.
   6. Aggiungere due o tre gocce di supporto di montaggio in tutta la diapositiva. Coprire la diapositiva con un coprivetrino. Evitare l'inclusione di bolle d'aria, in quanto ciò ostacola la valutazione microscopica. Asciugare i campioni almeno per una notte in una cappa aspirante.
6. Esecuzione della valutazione microscopica
   1. Per la visualizzazione e l'imaging, posizionare i vetrini in un microscopio a luce trasmessa con un ingrandimento di almeno 200x. Assicurarsi che il microscopio sia accoppiato a una fotocamera per scattare foto dei globuli rossi macchiati.
   2. Accendere la sorgente luminosa del microscopio. Accendere la fotocamera collegata al microscopio e avviare il software di controllo del microscopio. Utilizzare la microscopia a campo chiaro per determinare la messa a fuoco appropriata ruotando le manopole di regolazione della messa a fuoco grossolane e fini e trovando il livello di messa a fuoco in cui sono visibili i globuli rossi.
   3. Impostare i valori di sfondo delle immagini su 220 ± 5 valori di grigio, misurati su tre aree prive di celle della diapositiva. Per fare ciò, aprire la prima immagine utilizzando il software gratuito ImageJ. Selezionare l'opzione Valori medi di grigio utilizzando il pannello Imposta misure. Utilizzare l'icona ovale per misurare il valore grigio utilizzando il comando Misura . Se i valori misurati sono fuori portata, regolare di conseguenza la luce di fondo al microscopio. Ripetere questi passaggi finché i valori di sfondo non sono corretti.
      NOTA: questi valori di sfondo devono rientrare nell'intervallo specificato per tutte le immagini scattate. In caso contrario, i dati non sono comparabili.
   4. Per l'analisi del valore di grigio RBC, contrassegnare il bordo di ciascun RBC utilizzando lo strumento di selezione Oval all'interno del software ImageJ. Determinare i valori di grigio dei singoli RBC utilizzando il comando Misura . Misurare i valori di grigio di un minimo di 50 RBC dal test e un minimo di 10 RBC dall'area di controllo.
      NOTA: Il numero totale di globuli rossi analizzati può essere regolato individualmente. Più RBC analizzati, più significativo è il risultato. Tuttavia, il numero totale di globuli rossi analizzati dovrebbe essere confrontabile per ogni condizione, soggetto, ecc. all'interno di un determinato esperimento.
      1. Evitare l'analisi dei globuli rossi vicino alla matita grassa, poiché la colorazione potrebbe essere incompleta in quest'area. Evitare l'analisi dei globuli rossi sovrapposti, poiché ciò influisce sull'intensità della colorazione. Utilizzare solo RBC separati dagli altri RBC. Analizzare almeno cinque immagini dal test e almeno due immagini dall'area di controllo per la valutazione di 50/10 RBC. Includere RBC da ogni immagine nell'analisi finale.
   5. Per calcolare l'intensità della colorazione, calcola i segnali finali come:
      (RBC per area di prova individuale - sfondo medio dell'area di prova) - (RBC per area di controllo individuale - sfondo medio dell'area di controllo)

Figura 2: Rappresentazione del processo fissativo e della generazione di striscio di sangue. (Schema creato con BioRender.com.) I campioni di sangue diluiti vengono fissati chimicamente in paraformaldeide, quindi centrifugati e lavati con soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, il sangue risospeso viene spalmato su un vetrino e fissato termicamente passando sopra una fiamma del bruciatore Bunsen. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Condizioni di preparazione e conservazione delle soluzioni necessarie per la colorazione immunoistochimica. La soluzione può essere preparata prima del protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Descrizione delle soluzioni anticorpali per uso immediato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Componenti e protocollo per preparare la soluzione DAB per l'uso immediato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Marcatura fluorescente delle proteine RBC

NOTA: La sezione seguente delinea un adattamento del protocollo immunoistochimico, sviluppato con l'obiettivo di consentire l'uso di anticorpi con coniugati fluorescenti (Figura 1).

La preparazione del campione di sangue per il protocollo di immunofluorescenza è identica a quella descritta nel paragrafo 1, quindi la sezione seguente inizia dalla colorazione dei campioni.

1. Colorazione con immunofluorescenza
   1. Incubare con l'anticorpo secondario coniugato fluorescente (per il volume, vedere punto 1.4.2) per 30 minuti a RT al riparo dalla luce, utilizzando una camera di incubazione appositamente costruita o un foglio di alluminio.
   2. Versare la soluzione anticorpale secondaria e lavare i campioni 3 volte con TBS. Lasciare il lavaggio finale sui campioni per evitare che si secchino.
   3. Versare il TBS e rimuovere i campioni dal rack dei campioni uno alla volta per evitare un'esposizione prolungata alla luce. Per disidratare i campioni, esporre i vetrini a diverse soluzioni di etanolo per ~ 5 s ciascuna, iniziando con il 70%, seguito dal 90% e infine dal 100%. Esporre i vetrini alla soluzione di xilo/xilene per 5 s.
   4. Preparare un coprivetrino con due o tre gocce di supporto di montaggio e quindi montare il vetrino con il coprivetrino. Garantire una distribuzione uniforme del mezzo di montaggio applicando una leggera pressione con una pinzetta o uno strumento metallico sterile simile. Elimina le bolle d'aria, che altrimenti potrebbero interferire con l'imaging, con lo stesso strumento. Lasciare asciugare i campioni per una notte in uno spazio buio e asciutto.
2. Valutazione microscopica
   1. Per la visualizzazione e l'imaging, posizionare il vetrino sul palco del microscopio con un ingrandimento totale di almeno 400x. Accendere la sorgente luminosa del microscopio e la sorgente luminosa fluorescente, assicurandosi che la sorgente luminosa fluorescente sia regolata alla massima intensità.
   2. Accendere la fotocamera collegata al microscopio e avviare il software di controllo del microscopio. Utilizzare la microscopia a campo chiaro per determinare la messa a fuoco appropriata ruotando le manopole di regolazione della messa a fuoco grossolana e fine e trovando il livello di messa a fuoco in cui sono visibili i globuli rossi.
      NOTA: Un'eccessiva esposizione alla luce può causare il fotosbiancamento dei coniugati fluorescenti. Si può usare una diapositiva di un precedente esperimento per questo scopo, per ridurre al minimo l'esposizione alla luce dei vetrini che devono ancora essere analizzati.
   3. Determinare l'intensità laser ottimale ispezionando i globuli rossi nell'area di controllo. Assicurati che l'intensità sia abbastanza alta da rendere visibili i globuli rossi, senza produrre un segnale di fondo di grandi dimensioni. Mantenere l'intensità e il tempo di esposizione coerenti tra aree e campioni per garantire la comparabilità.
   4. Acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti in almeno tre aree distinte dell'area di test del vetrino, selezionate a caso. Per selezionare un'area, allontanatevi dai bordi della diapositiva contrassegnati dalla penna lipidica, utilizzando i controlli dello stage del microscopio. Selezionate un'area che mostri una distribuzione uniforme di un singolo livello RBC.
   5. Impostare il tempo di esposizione su 1 s per le immagini fluorescenti e acquisire un'immagine utilizzando i controlli software del software di controllo del microscopio. Passare alla modalità brightfield, impostare il tempo di esposizione su "Auto" e acquisire l'immagine in campo chiaro corrispondente.
   6. Acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti in almeno due aree distinte selezionate casualmente dell'area di controllo della diapositiva ripetendo il passaggio 2.2.3.
   7. Salvare le immagini in .tif formato per preservare i valori di grigio originali dei pixel, impedire la compressione e trasportare i metadati dell'acquisizione.
   8. Misurare i valori di grigio dei globuli rossi acquisiti. Aprire ImageJ (o FIJI²¹; vedere File supplementare 1). Determinare i valori di grigio dei singoli globuli rossi. A tal fine, contrassegnare ogni singola cella con lo strumento di selezione ovale e analizzare utilizzando il comando Misura .
      NOTA: i globuli rossi non devono essere analizzati se si sovrappongono ad altre celle, poiché ciò potrebbe aumentare il segnale risultante.
   9. Evidenziare da tre a cinque aree prive di globuli rossi e determinare i valori di grigio per fornire una misura del segnale di fondo. Analizzare almeno 150 RBC da almeno tre immagini distinte per ogni area di test e almeno 50 RBC da almeno due immagini distinte per ogni area di controllo.
      NOTA: L'analisi di più celle / aree può essere consigliata per ridurre al minimo la variabilità. Dato che la popolazione di globuli rossi è intrinsecamente eterogenea, la variabilità cellula-cellula nel segnale può essere significativa, a seconda della proteina di interesse.
   10. Eseguire analisi alternative dei dati delle immagini acquisite utilizzando il comando macro. Creare/installare un comando macro tramite la versione FIJI di ImageJ per la selezione automatica, la correzione dello sfondo e l'analisi dei valori di grigio di una determinata immagine.
       NOTA: questa routine utilizza la soglia automatica per rilevare le celle presenti in una determinata immagine utilizzando una copia dell'immagine originale, producendo una sovrapposizione che viene imposta sull'immagine originale per estrarre i valori di grigio dei globuli rossi fluorescenti. La macro viene depositata come file ijm, come file di codifica supplementare 1.
   11. Aprire il file immagine in .tif formato pronto per l'analisi nelle FIGI. Aprire la macro RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) e fare clic su Esegui.
       NOTA: la macro è impostata per immagini ottenute con ingrandimento 600x e un ampio rapporto segnale-rumore. La selezione automatica delle cellule deve essere esaminata dallo sperimentatore.
3. Calcola i segnali finali come:
   (area di prova RBC - sfondo area test) - (area di controllo RBC - sfondo area di controllo) per l'analisi manuale;
   (area di test - area di controllo) per analisi automatizzate.

Risultati

Il protocollo presentato, che descrive metodi che facilitano la rilevazione di alterazioni acute nelle proteine RBC, è stato testato su una ben nota alterazione proteica meccanicamente sensibile: la fosforilazione di RBC-NOS sul residuo di serina 1177. Il sangue intero è stato ottenuto da volontari sani e successivamente diviso in due aliquote separate. Un dato campione di sangue è stato esposto a sollecitazioni meccaniche di taglio di entità fisiologica (5 Pa) per 300 s, che in precedenza ha dimostrato di provocare ...

Discussione

La letteratura recente suggerisce altamente che la proteina RBC-NOS è di cruciale importanza per la regolazione della deformabilità dei globuli rossi 15,22,23^, che a sua volta facilita il loro passaggio attraverso capillari stretti ²⁴. L'attività proteica dipende fortemente dalle modificazioni proteiche post-traduzionali, in particolare dalla fosforilazione di alcuni residui¹⁸....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate	Sigma/Merck	D5637	DAB
Ammoniumchloride	Merck /Millipore	101145	NH4Cl
Centrifuge 5427 R	Eppendorf	5409000010
Coverslips	VWR	631-0147
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate	Merck /Millipore	106580	Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes	VWR	612-6803
Entellan	Merck /Millipore	107961	rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK)	Hofmann	642
Glucose-Oxidase	Sigma/Merck	G2133
Grease pencil	Dako	S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase	Sigma/Merck	E-2886	HRP
Hydrochloric acid	Merck /Millipore	109057	HCl
Hydrogen peroxide, 30%	Merck /Millipore	107203	H2O2
ImageJ Software	Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA)	RR Mechatronics		Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol	Merck /Millipore	106009
Microscope slides	VWR	630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate	Sigma/Merck	N4882	NiSO4.6H2O
Normal Goat serum	Agilent/DAKO	X0907	NGS
Paraformaldehyde	Merck /Millipore	818715	PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2	VWR	613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)	Merck/Millipore	07-428-I	Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml	Eppendorf	30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit	Agilent/DAKO	E0432	Secondary Antibody
Skim milk powder	Bio-Rad	170-6404
Sodium chloride	Merck /Millipore	106404	NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck /Millipore	106346	NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M	Merck /Millipore	150706	NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Merck /Millipore	108382	Tris
Trypsin	Sigma/Merck	T7409
Tween20	Merck /Millipore	822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F	Merck /Millipore	WHA1825047
Xylol	VWR Chemicals	2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate	Merck /Millipore	14431-43-7