Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Регистрация динамических изменений в белковой активации энуклеированных эритроцитов ставит перед нами методологические задачи, такие как сохранение динамических изменений острых стимулов для последующей оценки. Представленный протокол описывает методы пробоподготовки и окрашивания, которые позволяют сохранять и анализировать соответствующие изменения белка и последующее обнаружение.
Мечение антителами белков эритроцитов (эритроцитов) является широко используемым полуколичественным методом для обнаружения изменений в общем содержании белка или острых изменений в состояниях активации белка. Это облегчает оценку лечения эритроцитами, характеристику различий в определенных состояниях заболевания и описание клеточной когерентности. Обнаружение остро измененной активации белка (например, посредством механотрансдукции) требует соответствующей подготовки образца для сохранения временных модификаций белка. Основной принцип включает в себя иммобилизацию сайтов-мишеней связывания желаемых белков эритроцитов для обеспечения первоначального связывания специфических первичных антител. Образец подвергается дальнейшей обработке, чтобы гарантировать оптимальные условия для связывания вторичного антитела с соответствующим первичным антителом. Выделение нефлуоресцентных вторичных антител требует дополнительной обработки, включающей сопряжение биотин-авидин и применение 3,3-диаминобензидин-тетрагидрохлорида (DAB) для развития окрашивания, которое необходимо контролировать в режиме реального времени под микроскопом, чтобы вовремя остановить окисление и, следовательно, интенсивность окрашивания. Для определения интенсивности окрашивания изображения делаются с помощью стандартного светового микроскопа. В модификации этого протокола вместо него может быть применено флуоресцеин-конъюгированное вторичное антитело, преимущество которого заключается в том, что нет необходимости в дальнейшем этапе разработки. Эта процедура, однако, требует флуоресцентного объектива, прикрепленного к микроскопу для обнаружения окрашивания. Учитывая полуколичественный характер этих методов, крайне важно обеспечить несколько контрольных красителей для учета неспецифических реакций антител и фоновых сигналов. Здесь мы представляем как протоколы окрашивания, так и соответствующие аналитические процессы, чтобы сравнить и обсудить соответствующие результаты и преимущества различных методов окрашивания.
Эритроциты (эритроциты) проходят через сердечно-сосудистую систему в течение 70-140 дней, при этом средний возраст эритроцитов составляет примерно 115 дней1,2. Стареющие или поврежденные эритроциты удаляются из кровотока с помощью эритрофагоцитоза, эффективного процесса очистки, управляемого макрофагами3. Предопределенная продолжительность жизни этих клеток является одним из следствий отказа клеточных органелл, включая ядро, митохондрии и рибосомы, во время дифференцировки исозревания. Таким образом, циркулирующие эритроциты лишены трансляционного механизма, препятствующего синтезу новых белков3. Из этого следует, что динамические, посттрансляционные модификации существующих белков представляют собой единственный жизнеспособный механизм острой биохимической регуляции в ответ на внеклеточные и внутриклеточные стрессоры, действующие на эритроциты5.
Механические силы, по-видимому, являются основными внеклеточными сигналами, которые вызывают активацию или модуляцию биохимических путей в эритроцитах. Открытие механочувствительного белка Piezo1 в мембранах эритроцитов6 вдохновило несколько направлений исследований, изучающих механически активированную передачу сигналов в этих клетках7. Например, последние достижения показали, что физические свойства эритроцитов активно регулируются острыми и динамическими изменениями белков8, включая посттрансляционное фосфорилирование и убиквитинирование9. Поскольку эти нормальные модификации различаются при определенных заболеваниях 9,10,11, представляется научным и клиническим интересом определение состояния активации белков эритроцитов, особенно в отношении механобиологических процессов.
Определение острых изменений состояний активации белка эритроцитов ставит ряд методологических задач. Например, хранение образцов эритроцитов для последующего анализа требует сохранения модифицированных белков эритроцитов, так как посттрансляционные модификации недолговечны. Более того, классические методы обнаружения белка (например, вестерн-блоттинг), как известно, трудно стандартизировать в эритроцитах из-за низкого содержания белков по отношению к гемоглобину, на долю которого приходится ~98% содержания белка в этих клетках12. Таким образом, окрашивание химически консервированных эритроцитов на основе антител является методом выбора при исследовании острых модификаций важных белков эритроцитов, таких как эритро-специфическая изоформа синтазы оксида азота (RBC-NOS)13,14. Было показано, что RBC-NOS ферментативно продуцирует оксид азота (NO), который, по-видимому, необходим для основных свойств эритроцитов, включая деформируемость эритроцитов15,16,17. Посттрансляционные модификации RBC-NOS регулируют каталитическую активность фермента, при этом фосфорилирование остатка серина 1177 описано для увеличения активности фермента, в то время как фосфорилирование остатков серина 114 или треонина 495 было связано со снижением активности RBC-NOS18,19.
В совокупности временные модификации белков эритроцитов вносят свой вклад в важную клеточную функцию, и стандартизированные протоколы, позволяющие обнаруживать эти модифицированные белки, имеют высокую ценность. В этой статье мы представим два различных протокола, которые используют специфические антитела для облегчения обнаружения активации белка RBC-NOS, и обсудим рекомендации по анализу и интерпретации данных.
Эффективность описанных протоколов оценивалась путем измерения хорошо зарегистрированного увеличения фосфорилирования RBC-NOS в остатке серина 1177 в ответ на механические силы, отражающие те, которые происходят в сосудистой сети человека (5 Па).
Протоколы, описанные здесь, соответствуют Хельсинкской декларации и были одобрены комитетами по этике Немецкого университета спорта в Кельне (16.09.2013) и Университета Гриффита (2019/808). Добровольцы прошли скрининг на отсутствие соответствующих патологий и получили письменное информированное согласие.
1. Окрашивание белков эритроцитов по протоколам иммуногистохимии
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный список необходимых химикатов и материалов приведен в таблице материалов. В следующих разделах описывается приготовление необходимых растворов, за которыми следует подробное описание протокола иммуногистохимии (рис. 1).
Рисунок 1: Схема отдельных этапов, необходимых для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания эритроцитов-NOS в сайте фосфорилирования 1177. Представлен типичный рабочий процесс представленных протоколов, охватывающий период от приготовления раствора и забора крови до обнаружения и визуализации на основе антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображение процесса фиксации и образования мазка крови. (Схема создана с помощью BioRender.com.) Разбавленные образцы крови химически фиксируют в параформальдегиде, затем центрифугируют и промывают фосфатно-солевым буфером. Наконец, ресуспендированная кровь размазывается по предметному стеклу и термически фиксируется путем зависания над пламенем горелки Бунзена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Условия приготовления и хранения растворов, необходимых для иммуногистохимического окрашивания. Раствор может быть приготовлен до протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Описание растворов антител для немедленного применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Компоненты и протокол подготовки раствора DAB к немедленному использованию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
2. Флуоресцентное мечение белков эритроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описывается адаптация иммуногистохимического протокола, разработанного с целью обеспечения возможности использования антител с флуоресцентными конъюгатами (рис. 1).
Подготовка образцов крови для протокола иммунофлюоресценции идентична той, что описана в разделе 1, поэтому следующий раздел начинается с окрашивания образцов.
Представленный протокол, описывающий методы, облегчающие выявление острых изменений в белках эритроцитов, был апробирован на известном механически чувствительном изменении белка: фосфорилировании эритроцитов-NOS по остатку серина 1177. Цельная кровь была получена от здоровых доброволь...
В современной литературе высказывается предположение, что белок RBC-NOS имеет решающее значение для регуляции деформируемости эритроцитов 15,22,23, что, в свою очередь, облегчает их прохождение через узкие капилляры 24. Активнос...
Все авторы сообщили, что конфликт интересов отсутствует.
LK выражает признательность за поддержку стипендии Австралийской государственной программы подготовки научных кадров.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
Coverslips | VWR | 631-0147 | |
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
Grease pencil | Dako | S 2002 | |
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
ImageJ Software | Freeware | ||
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены