É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Method Article
A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.
A marcação de anticorpos de proteínas eritrocitárias é um método semiquantitativo comumente usado para detectar mudanças no conteúdo global de proteínas ou alterações agudas em estados de ativação proteica. Facilita a avaliação de tratamentos eritrocitários, a caracterização de diferenças em determinados estados patológicos e a descrição de coerências celulares. A detecção de ativação proteica agudamente alterada (por exemplo, através de mecanotransdução) requer preparação adequada da amostra para preservar modificações proteicas temporárias. O princípio básico inclui a imobilização dos sítios de ligação alvo das proteínas eritrocitárias desejadas para permitir a ligação inicial de anticorpos primários específicos. A amostra é posteriormente processada para garantir condições ideais para a ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário correspondente. A seleção de anticorpos secundários não fluorescentes requer tratamento adicional, incluindo o acoplamento biotina-avidina e a aplicação de 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) para desenvolver a coloração, que precisa ser controlada em tempo real sob um microscópio para interromper a oxidação e, assim, colorir a intensidade a tempo. Para a detecção da intensidade da coloração, as imagens são obtidas usando um microscópio de luz padrão. Em uma modificação deste protocolo, um anticorpo secundário conjugado à fluoresceína pode ser aplicado em seu lugar, o que tem a vantagem de que nenhuma etapa adicional de desenvolvimento é necessária. Este procedimento, no entanto, requer uma objetiva de fluorescência acoplada a um microscópio para detecção da coloração. Dada a natureza semiquantitativa desses métodos, é imperativo fornecer várias colorações de controle para explicar reações de anticorpos inespecíficos e sinais de fundo. Aqui, apresentamos os protocolos de coloração e os processos analíticos correspondentes para comparar e discutir os respectivos resultados e vantagens das diferentes técnicas de coloração.
As hemácias (hemácias) atravessam o sistema cardiovascular por 70 a 140 dias, com idade média das hemácias de aproximadamente 115 dias 1,2. As hemácias senescentes ou lesadas são removidas da circulação por eritrofagocitose, um eficiente processo de clareamento conduzido por macrófagos3. O tempo de vida predeterminado dessas células é uma consequência da entrega das organelas celulares, incluindo o núcleo, as mitocôndrias e os ribossomos, durante a diferenciação e maturação4. Assim, as hemácias circulantes são desprovidas de maquinaria translacional, impossibilitando a síntese de novas proteínas3. Conclui-se que modificações dinâmicas e pós-traducionais em proteínas existentes representam o único mecanismo viável de regulação bioquímica aguda em resposta a estressores extracelulares e intracelulares que atuam sobre as hemácias5.
As forças mecânicas parecem ser as principais pistas extracelulares que causam a ativação ou modulação de vias bioquímicas dentro das hemácias. A descoberta da proteína mecanossensível, Piezo1, em membranas eritrocitárias6 inspirou várias linhas de pesquisa investigando a sinalização ativada mecanicamente nessas células7. Por exemplo, avanços recentes têm mostrado que as propriedades físicas das hemácias são ativamente reguladas por mudanças agudas e dinâmicas das proteínas8, o que inclui fosforilação pós-traducional e ubiquitinação9. Como essas modificações normais diferem em certas doenças 9,10,11, parece ser de interesse científico e clínico determinar o estado de ativação das proteínas eritrocitárias, especificamente em relação aos processos mecanobiológicos.
A determinação de alterações agudas nos estados de ativação de proteínas eritrocitárias apresenta alguns desafios metodológicos. Por exemplo, o armazenamento de amostras de hemácias para análise posterior requer a preservação das proteínas eritrocitárias modificadas, uma vez que as modificações pós-traducionais não são duráveis. Além disso, os métodos clássicos de detecção de proteínas (por exemplo, western blotting) são notoriamente difíceis de padronizar em hemácias devido à baixa abundância de proteínas em relação à hemoglobina, que responde por ~98% do conteúdo proteico nessas células12. Assim, a coloração de hemácias quimicamente preservadas com base em anticorpos tem sido o método de escolha na investigação de modificações agudas de importantes proteínas eritrocitárias, como a isoforma eritrocitária específica da óxido nítrico sintase (RBC-NOS)13,14. Demonstrou-se que as hemácias-NOS produzem enzimaticamente óxido nítrico (NO), o que parece indispensável para propriedades essenciais das hemácias, incluindo a deformabilidade das hemácias15,16,17. Modificações pós-traducionais de RBC-NOS regulam a atividade enzimática catalítica, com a fosforilação do resíduo de serina 1177 sendo descrita para aumentar a atividade enzimática, enquanto a fosforilação dos resíduos serina 114 ou treonina 495 tem sido associada à diminuição da atividade de RBC-NOS18,19.
Coletivamente, modificações temporárias de proteínas eritrocitárias contribuem para importante função celular, e protocolos padronizados que permitem a detecção dessas proteínas modificadas são de alto valor. Aqui, apresentamos dois protocolos distintos que exploram anticorpos específicos para facilitar a detecção da ativação da proteína eritrocitária-NOS, e discutimos recomendações para análise e interpretação dos dados.
O desempenho dos protocolos descritos foi avaliado medindo-se o aumento bem relatado na fosforilação de eritrócitos-NOS no resíduo de serina 1177 em resposta a forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa).
Os protocolos aqui descritos estão alinhados com a Declaração de Helsinque e foram aprovados pelos Comitês de Ética da Universidade Alemã de Esportes de Colônia (16/9/2013) e da Universidade Griffith (2019/808). Os voluntários foram triados para garantir a ausência de patologias relevantes e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Coloração de proteínas eritrocitárias utilizando protocolos de imunohistoquímica
NOTA: Uma lista detalhada dos produtos químicos e materiais necessários é fornecida na Tabela de Materiais. As seções a seguir descrevem o preparo das soluções necessárias, seguidas de uma descrição detalhada do protocolo de imuno-histoquímica (Figura 1).
Figura 1: Esquema dos passos individuais necessários para a coloração imunoistoquímica e imunofluorescência das hemácias-NOS no sítio de fosforilação 1177. Um fluxo de trabalho típico dos protocolos apresentados, desde o preparo da solução e coleta de sangue até a detecção e visualização baseada em anticorpos, é apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação do processo fixador e geração de esfregaço sanguíneo. (Esquema criado com BioRender.com.) As amostras de sangue diluídas são fixadas quimicamente em paraformaldeído, depois centrifugadas e lavadas com solução salina tamponada com fosfato. Finalmente, o sangue ressuspendido é manchado em uma lâmina de vidro e fixado termicamente através do pairar sobre uma chama de queimador de Bunsen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Condições de preparo e armazenamento das soluções necessárias para a coloração imunoistoquímica. A solução pode ser preparada antes do protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Descrição das soluções de anticorpos para uso imediato. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Componentes e protocolo para preparar a solução DAB para uso imediato. Clique aqui para baixar esta tabela.
2. Marcação fluorescente de proteínas eritrocitárias
NOTA: A seção a seguir descreve uma adaptação do protocolo de imunohistoquímica, desenvolvido com o objetivo de possibilitar o uso de anticorpos com conjugados fluorescentes (Figura 1).
A preparação da amostra de sangue para o protocolo de imunofluorescência é idêntica à descrita na secção 1, pelo que a secção seguinte começa a partir da coloração das amostras.
O protocolo apresentado, descrevendo métodos que facilitam a detecção de alterações agudas em proteínas eritrocitárias, foi testado em uma conhecida alteração proteica mecanicamente sensível: a fosforilação de hemácias-NOS no resíduo de serina 1177. O sangue total foi obtido de voluntários saudáveis e posteriormente dividido em duas alíquotas separadas. Uma determinada amostra de sangue foi exposta a tensão de cisalhamento mecânica de magnitude fisiológica (5 Pa) por 300 s, que foi previamente demonst...
A literatura recente sugere que a proteína RBC-NOS é de fundamental importância para a regulação da deformabilidade das hemácias 15,22,23, o que, por sua vez, facilita sua passagem por capilares estreitos 24. A atividade proteica depende fortemente de modificações proteicas pós-traducionais, particularmente da fosforilação de certos resíduos18. O foco de interesse est?...
Todos os autores declararam não haver conflitos de interesse.
A LK reconhece o apoio de uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
Coverslips | VWR | 631-0147 | |
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
Grease pencil | Dako | S 2002 | |
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
ImageJ Software | Freeware | ||
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados