改良自体条件血清的生产及其在小鼠角膜上皮中愈合潜力的离 体 评估

摘要

本文介绍了一种简化工艺并使自体条件反射血清（ACS）制备成本更低的方案。无需特殊的注射器或表面涂层玻璃珠。此外，改良的ACS（mACS）在鼠眼离体角膜伤口愈合方面比传统自 体血清具有竞争优势。

摘要

近几十年来，人类血液来源的局部疗法一直是临床医生的福音。自体血清 （AS） 和富血小板血浆 （PRP） 富含对角膜伤口愈合至关重要的促上皮生长因子。与AS不同，PRP基于差异离心系统，产生更多的血小板衍生生长因子。自体条件血清（ACS）不仅保留了AS和PRP的制备，而且还专注于免疫调节特性，这在炎症性疾病中很重要。

缺乏标准化的方案和高昂的制备成本是ACS临床应用的局限性。该视频实验演示了制备改良自体条件血清（mACS）滴眼液的标准操作程序。首先，在缺氧孵育期间将甘油作为血细胞稳定剂加入肝素注射器中。为了激活血细胞，在37°C下开始孵育4小时。然后，将血液样品在室温下以3，500× g 离心10分钟。通过0.22μm过滤器过滤上清液后，充分制备mACS滴眼液。

对mACS治疗效果的初步试验表明，在离 体 小鼠眼睛的角膜伤口愈合方面，mACS可能比传统AS具有竞争优势。本研究中使用的AS是根据已发表的研究和我院的临床实践制备的。因此，mACS对眼表疾病的疗效可以在未来的研究中通过 体内 动物研究和临床试验来评估。

引言

自体血清（AS）对干眼症的治疗效果最早由Fox等人在1980年代报道^1。据信，AS中的润滑性能和必需的上皮生化成分，模仿天然泪液，有利于角膜上皮细胞的增殖。在过去的几十年里，已经在此基础上进行了几项研究。营养成分包括表皮生长因子（EGF）、维生素A、转化生长因子β（TGF-β）和其它细胞因子。有趣的是，血清富含TGF-β和维生素A，它们被认为在表皮增殖中起着关键作用^{2，3，4，5}。此外，在治疗眼表疾病患者时，多项研究表明AS滴眼液在患者报告的结果，其他客观干眼参数^6，7和微观发现（如细胞密度⁸）中具有一些优势。荟萃分析研究表明，AS滴眼液治疗可能有一些改善患者综合征的益处，但长期结果和观察结果仍然缺乏^9，10。

与AS不同，富血小板血浆（PRP）是通过在制备过程中添加抗凝剂，进一步差异离心和血小板化学活化而获得的。与AS相比，PRP中存在许多化学物质和生长因子，例如TGF-β，血管内皮生长因子（VEGF）和EGF。它也已被应用于眼表疾病，在缓解症状方面具有临床益处¹¹。

上皮缺损和炎症之间的交联很复杂。值得注意的是，免疫病理生理学是眼表疾病的另一个重要问题。促炎细胞因子，如IL-1β和IFN-γ，被认为是炎症级联反应的关键介质¹²。因此，基于对免疫机制的理解，开辟了新的治疗途径。阻止这种炎症过程的策略，包括白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）和其他抗炎细胞因子的产生，也可能在眼表疾病中发挥重要作用¹³，^14，15。

自 1998 年以来，Orthokine 是一种商业化的自体条件血清 （ACS），已在临床上用于患有骨关节炎 （OA）、类风湿性关节炎 （RA） 和脊柱疾病的骨科患者¹³。与AS和PRP相比，ACS¹⁶的特点是用化学涂层玻璃珠处理和缺氧孵育以激活单核细胞。从理论上讲，通过向细胞增加生存压力可以分泌更多的抗炎因子，导致更高浓度的必需免疫调节成分，包括IL-1Ra。据报道，与AS相比，ACS在OA中的治疗益处有所改善¹⁷。在某些方面，眼表疾病与骨科炎症性疾病具有相似的免疫背景。因此，基于人血源性治疗在骨科领域的成功结果，ACS在临床上皮细胞增效性和免疫调节特性方面可能优于常规治疗。虽然ACS已广泛应用于骨科炎症性疾病，但其在眼科的临床应用仍有待探索，可能因其成本高、缺乏文献支持、制备工艺缺乏规范等原因而受到阻碍，导致性能参差不齐。

在本视频文章中，展示了一种新颖、经济高效且方便的方法来生成修饰的 ACS （mACS） 或富含生长因子的血浆 （PRGF），从而生产出与商业化 ACS 具有相当实用价值的滴眼液。保留了添加抗凝剂和通过应激孵育触发血细胞分泌抗炎细胞因子的关键思想，但与化学诱导的方法（例如基于CrSO₄涂层玻璃珠和商用试剂盒的方法）不同，该方法的临界应激状态是由缺氧孵育物理诱导的。此外，添加甘油以提供额外的益处，包括增加血细胞膜的稳定性，维持适当的渗透细胞外液压力¹⁸，以及在缺氧条件下避免细胞过度压力的适当营养来源。

研究方案

该研究是根据协议部分开头的机构指南进行的。所有协议和程序均根据《赫尔辛基宣言》进行，并由长庚医学基金会机构审查委员会审查和批准。所有志愿者都被告知这项研究的性质，并在纳入之前签署了一份知情同意书。整个实验过程所需的耗材如图 1 和 图2以及 材料表所示。

1. 制备生产mACS滴眼液所需的材料

1. 准备 250 mL 的 10% 甘油溶液，并准备好 21 G 蝶翼输液器、没有针头的 3 mL 注射器和六个含有肝素 158 USP 单位的 10 mL 真空管（图 1）。
2. 将21 G采血针头连接到3 mL注射器，并将3 mL 10%甘油溶液撤回到制备的注射器中。
   注意:在插入针头之前，必须对所有材料进行消毒。
3. 将 10% 甘油溶液按顺序分配到真空管中，每个溶液中含有约 0.5 mL 的 10% 甘油溶液（图 3A）。
   注意:由于试管中的负压，针头在进入后必须立即取出，以将3 mL甘油溶液均匀分布到六个试管中。
4. 用75%酒精无菌棉签对患者的皮肤进行消毒。用18G采血针刺穿患者上肢的浅静脉。总共从浅静脉抽取 60-70 mL 静脉血。

2. mACS滴眼液的准备

1. 依次将 10 mL 抽取的静脉血注入六个真空管中的每一个（图 3B）。
   注意:此步骤依靠真空的负压来填充管子。为避免血细胞破碎和溶血，请勿施加任何正压。
2. 将六个真空管置于恒温为37°C的培养箱中4小时（图3C）。
   注意:缺氧状态通过接受甘油的密封管中的剩余负压来维持和稳定。
3. 4小时后从培养箱中取出试管，并在室温下以3，500× g 离心10分钟。
4. 此时，准备用于mACS提取的材料，包括灭菌的滴眼液瓶，带针头的3 mL注射器，0.22 μm过滤器，18 G针头和一副无菌手套（图2）。
   注意:手术台应用75%的酒精擦拭，以确保无菌环境。离心后的上清液已经是mACS的半成品。
5. 将六个试管放在试管架上，并在完全离心后打开盖子（图3D）。
   注意:此步骤不需要无菌。
6. 戴上无菌手套，使用带有 18 G 针头的 3 mL 注射器逐个拉出 mACS。
   注意:在此步骤中注意不要绘制下层血细胞层（图3E）。
7. 拉出针头，将其连接到0.22μm过滤器，然后将23 G，1.5 in采血针头与原始的3 mL注射器连接到下面的出口（图3F）。
8. 将针头轻轻地通过0.22μm过滤器推入准备好的无菌滴眼液瓶中（图3G）。
9. 重复上述步骤，直到所有mACS都被过滤并储存在眼药水瓶中（图3H）。
10. 将mACS滴眼液储存在4°C下立即使用;储存在-20°C以长期保存。
    注意:不要在4°C下保存超过2周或在-20^°C下保存超过3个月9^，19。

3. 小鼠角膜上皮离 体 伤口愈合模型

注:以下离 体 动物模型基于Hung等人关于角膜上皮²⁰机械损伤的先前经验。应在显微镜下执行以下步骤，以形成边界清晰且一致的角膜上皮伤口。

1. 用3%-4%异氟醚麻醉C57BL / 6小鼠。将皮肤活检打孔压在小鼠中央角膜上，在上皮上留下一个浅圆圈，作为均匀的伤口边缘。
   注意:要轻柔，以免眼球破裂。
2. 在确认区域内清创角膜上皮直至Bowman层，使用配备0.5毫米毛刺的角膜锈环去除器。
3. 建立机械角膜伤口的 离体 动物模型，收获眼球并做好培养准备。
   1. 首先对小鼠实施安乐死;然后，轻轻按压小鼠的上眶和下眶边缘，将镊子的尖端引入球后空间，然后伸出眼球并用镊子握住它。
   2. 用角膜剪刀切割视神经和眶周软组织，以完美隔离眼球。
   3. 准备一个 96 孔板，里面有融化的蜡。使用镊子的尖端快速创建一个圆孔，然后等待凝固。
4. 准备要测试的培养基:0.5%mACS，0.5%AS进行比较，生理盐水作为阴性对照，以及Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）。
   注意:mACS是使用上述协议获得的。
5. 对于 离体 培养，将收获的眼球放在准备好的 96 孔板上。将 200 μL 每种培养基加入 96 孔板中。
6. 将96孔培养板放入37°C的培养箱中，并加入5%CO₂。确保每24小时更换一次培养基。
7. 为了确认顺序伤口愈合效果，通过荧光素染色每8小时在显微镜下监测上皮伤口区域。
   1. 用生理盐水将荧光素溶解在荧光素纸上。
   2. 将荧光素染料滴在小鼠中央角膜上，然后在显微镜下观察并记录下来。典型结果如图 4所示。
      注意:一滴（约0.05毫升）荧光素染料足以进行观察。

结果

图1和图2显示了实验所需的材料，图3显示了mACS制备过程中的顺序步骤和成功的中间产品。首先，将0.5mL的10%甘油溶液加入到每个10mL无菌试管中（图3A）。然后，从患者获得60-70mL静脉血，并将10mL血液注射到每个管中（图3B）。在制备之前，必须对患者的血液进行彻底、定期的实验室检查...

讨论

在本研究中，描述了制备mACS的方案，并进一步显示了mACS滴眼液在动物模型伤口愈合中的益处。该mACS方案的关键修改是在每个试管中加入约0.5mL的10%甘油溶液，这在37°C孵育4小时期间产生合适的缺氧条件。 此设置为AS提供适当的压力，并促使细胞分泌有助于伤口愈合的必要生长因子。0.22 μm 过滤器可以帮助消除大分子蛋白质、血细胞和杂质，从而使最终产品纯净且粘附更少。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004