Производство модифицированной аутологичной кондиционированной сыворотки и оценка ex vivo ее лечебного потенциала в эпителии роговицы мышей

Резюме

В этой статье описывается протокол, позволяющий упростить процесс и сделать приготовление аутологичной кондиционированной сыворотки (ОКС) менее дорогим. Никаких специальных шприцев или стеклянных шариков с поверхностным покрытием не требуется. Кроме того, модифицированная ОКС (mACS) имеет конкурентные преимущества перед обычной аутологичной сывороткой при заживлении ран роговицы мышиных глаз ex vivo.

Аннотация

В последние десятилетия местная терапия, полученная из крови человека, была благом для клиницистов. Аутологичная сыворотка (AS) и обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) обогащены эпителиотропными факторами роста, которые необходимы для заживления ран роговицы. В отличие от AS, PRP основана на системе дифференциального центрифугирования, что дает больше тромбоцитарных факторов роста. Аутологичная кондиционированная сыворотка (ОКС) не только сохраняет препарат АС и PRP, но и фокусируется на иммуномодулирующих свойствах, которые важны при воспалительных заболеваниях.

Отсутствие стандартизированных протоколов и высокие затраты на подготовку являются ограничениями для клинического применения ОКС. Этот видеоэксперимент демонстрирует стандартную операционную процедуру приготовления глазных капель модифицированной аутологичной кондиционированной сыворотки (mACS). Во-первых, глицерин добавляли в гепариновые шприцы в качестве стабилизатора клеток крови во время гипоксической инкубации. Для активации клеток крови была начата 4-часовая инкубация при 37 ° C. Затем образцы крови центрифугировали при 3 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. После фильтрации надосадочной жидкости через фильтр 0,22 мкм глазные капли mACS были полностью приготовлены.

Предварительная проверка терапевтического эффекта mACS показала, что он может иметь конкурентные преимущества перед обычным АС при заживлении ран роговицы в глазах мышей ex vivo . АС, использованная в этом исследовании, была подготовлена в соответствии с опубликованными исследованиями и клинической практикой в нашей больнице. Таким образом, эффективность mACS при заболеваниях глазной поверхности может быть оценена в будущих исследованиях с помощью исследований in vivo на животных и клинических испытаний.

Введение

Терапевтические эффекты аутологичной сыворотки (АС) при заболеваниях сухого глаза были впервые зарегистрированы в 1980-х годах Fox et ^al.1. Считается, что как смазывающее свойство, так и основные эпителиотропные биохимические компоненты АС, имитирующие естественные слезы, способствуют пролиферации эпителиальных клеток роговицы. За последние десятилетия на этой основе было проведено несколько исследований. Трофические компоненты включают эпидермальный фактор роста (EGF), витамин А, трансформирующий фактор роста β (TGF-β) и другие цитокины. Интересно, что сыворотка богата TGF-β и витамином А, которые, как полагают, играют ключевую роль в пролиферации эпидермиса 2,3,4,5. Кроме того, при лечении пациентов с заболеваниями глазной поверхности несколько исследований показали некоторые преимущества глазных капель АС в исходах, сообщаемых пациентами, других объективных параметрах^сухого глаза ^6,7 и микроскопических данных^, таких как плотность клеток⁸. Метааналитические исследования показали, что при лечении глазными каплями АС могут быть некоторые преимущества в улучшении синдромов пациентов, но долгосрочные результаты и наблюдения по-прежнему отсутствуют ^9,10.

В отличие от АС, обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) получается путем добавления антикоагулянта во время приготовления с дальнейшим дифференциальным центрифугированием и химической активацией тромбоцитов. По сравнению с АС, в PRP присутствуют многочисленные химические вещества и факторы роста, такие как TGF-β, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и EGF. Он также применялся к заболеваниям глазной поверхности с клиническими преимуществами в облегчении симптомов¹¹.

Перекрестная связь между дефектами эпителия и воспалением сложна. Примечательно, что иммунопатофизиология является еще одним важным вопросом при заболеваниях глазной поверхности. Считается, что провоспалительные цитокины, такие как IL-1β и ИФН-γ, являются ключевыми медиаторами в воспалительных каскадах¹². Таким образом, открываются новые пути лечения, основанные на понимании иммунного механизма. Стратегии остановки этого воспалительного процесса, включая выработку антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra) и других противовоспалительных цитокинов, также могут играть важную роль при заболеваниях глазной поверхности^13,14,15.

С 1998 года Orthokine, коммерциализированная аутологичная кондиционированная сыворотка (ACS), клинически используется у ортопедических пациентов, страдающих остеоартритом (ОА), ревматоидным артритом (РА) и заболеваниями позвоночника¹³. По сравнению с АС и PRP, обработка стеклянными шариками с химическим покрытием и гипоксическая инкубация для активации моноцитов являются специфическими особенностями ACS¹⁶. Теоретически можно секретировать больше противовоспалительных факторов путем добавления стресса выживания к клеткам, что приводит к более высокой концентрации основных иммуномодулирующих компонентов, включая IL-1Ra. Также сообщалось об улучшении терапевтических преимуществ ОКС при ОА по сравнению с АС¹⁷. Заболевания глазной поверхности в некоторых отношениях имеют сходную иммунную подоплеку с ортопедическими воспалительными заболеваниями. Таким образом, основываясь на успешных результатах терапии крови человека в ортопедической области, ОКС может иметь преимущества перед традиционными методами лечения в клинической практике по эпителиотропным и иммуномодулирующим свойствам. Несмотря на то, что ОКС широко используется при ортопедических воспалительных заболеваниях, его клиническое применение в офтальмологии все еще нуждается в изучении, что может быть затруднено его высокой стоимостью, отсутствием литературной поддержки и отсутствием стандартизации процесса подготовки, что приводит к разнообразным характеристикам.

В этой видеостатье был продемонстрирован новый, экономически эффективный и удобный метод создания модифицированной ACS (mACS) или плазмы, богатой факторами роста (PRGF), для получения глазных капель с сопоставимой практической ценностью с коммерциализированными ACS. Ключевые идеи добавления антикоагулянтов и запуска клеток крови для секреции противовоспалительных цитокинов путем стрессовой инкубации были сохранены, но в отличие от химически индуцированных методов, таких как основанные на стеклянных шариках с покрытием_{CrSO 4} и коммерческих наборах, критический стрессовый статус физически индуцируется гипоксической инкубацией в этом методе. Кроме того, глицерин был добавлен для обеспечения дополнительных преимуществ, включая повышение стабильности мембраны клеток крови, поддержание надлежащего осмотического давления внеклеточной жидкости¹⁸ и соответствующий источник питательных веществ в гипоксических условиях, которые позволяют избежать перенапряжения клеток.

протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными руководящими принципами, изложенными в начале раздела протокола. Все протоколы и процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинского фонда Чан Гун. Все добровольцы были проинформированы о характере этого исследования и подписали форму информированного согласия до их включения. Расходные материалы, необходимые для всей экспериментальной процедуры, представлены на рисунках 1 и 2, а также в таблице материалов.

1. Подготовка материалов, необходимых для производства глазных капель mACS

1. Приготовьте 250 мл 10% раствора глицерина и держите наготове инфузионный набор с крылом бабочки весом 21 г, шприц объемом 3 мл без иглы и шесть вакуумных пробирок по 10 мл, содержащих гепарин 158 единиц USP (рис. 1).
2. Подсоедините иглу для забора крови 21 г к шприцу объемом 3 мл и наберите 3 мл 10% раствора глицерина в подготовленный шприц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы должны быть стерилизованы перед введением иглы.
3. Распределите 10% раствор глицерина в вакуумные пробирки последовательно, по примерно 0,5 мл 10% раствора глицерина в каждой (рис. 3А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за отрицательного давления в пробирке игла должна выйти сразу после входа, чтобы равномерно распределить 3 мл раствора глицерина по шести пробиркам.
4. Стерилизуйте кожу пациента стерильными ватными тампонами со стерильным 75% спиртом. Проколите поверхностную вену верхних конечностей пациента иглой для забора крови 18 G. Всего из поверхностной вены берут 60-70 мл венозной крови.

2. Подготовка к глазным каплям mACS

1. Последовательно введите 10 мл взятой венозной крови в каждую из шести вакуумных пробирок (рис. 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от отрицательного давления вакуума для заполнения трубок. Чтобы избежать разрушения клеток крови и гемолиза, не прикладывайте никакого положительного давления.
2. Поместите шесть вакуумных пробирок в инкубатор с постоянной температурой 37 °C на 4 часа (рис. 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксический статус поддерживается и стабилизируется оставшимся отрицательным давлением в герметичной пробирке, в которую поступал глицерин.
3. Через 4 ч выньте пробирки из инкубатора и центрифугируйте их при концентрации 3 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
4. На этом этапе подготовьте материалы для экстракции mACS, включая стерилизованные флаконы с глазными каплями, шприц объемом 3 мл с иглой, фильтр 0,22 мкм, иглу 18 G и пару стерильных перчаток (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операционный стол следует протереть 75% спиртом, чтобы обеспечить асептическую среду. Надосадочная жидкость после центрифугирования уже является полуфабрикатом mACS.
5. Поместите шесть пробирок на стойку для пробирок и откройте крышки после полного центрифугирования (рис. 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильность на этом этапе не требуется.
6. Наденьте стерильные перчатки и вытащите mACS один за другим с помощью шприца объемом 3 мл с иглой 18 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарисовать нижний слой клеток крови на этом этапе (рис. 3E).
7. Вытащите иглу, подсоедините ее к фильтру 0,22 мкм и подсоедините иглу для сбора крови 23 G, 1,5 дюйма оригинальным шприцем объемом 3 мл к выходному отверстию ниже (рис. 3F).
8. Осторожно протолкните иглу через фильтр 0,22 мкм в подготовленные стерильные флаконы с глазными каплями (рис. 3G).
9. Повторяйте описанные выше шаги до тех пор, пока все mACS не будут отфильтрованы и сохранены во флаконах с глазными каплями (рис. 3H).
10. Храните глазные капли mACS при температуре 4 °C для немедленного использования; хранить при температуре -20 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните их более 2 недель при температуре 4 ° C или более 3 месяцев при -20 ° C ^9,19.

3. Модель заживления ран эпителия роговицы мыши ex vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая модель животных ex vivo была основана на предыдущем опыте Hung et al. по механическим повреждениям эпителия^{роговицы 20}. Следующие шаги должны быть выполнены под микроскопом, чтобы создать хорошо очерченную и последовательную эпителиальную рану роговицы.

1. Анестезируйте мышей C57BL/6 3%-4% изофлураном. Вдавливайте удар биопсии кожи над центральной роговицей мыши, оставляя неглубокий круг на эпителии в качестве однородного края раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать разрыва глазного яблока.
2. Удалите эпителий роговицы в пределах подтвержденной области вплоть до слоя Боумена с помощью кольца для удаления ржавчины роговицы, оснащенного заусенцем 0,5 мм.
3. Чтобы создать животную модель механической раны роговицы ex vivo , соберите глазное яблоко и хорошо подготовьте культуру.
   1. Сначала усыпьте мышей; Затем осторожно надавите на верхний и нижний орбитальные ободки мышей, введите кончик щипцов над ретробульбарным пространством, вытащите глазное яблоко и удерживайте его за щипцы.
   2. Разрежьте зрительный нерв и периорбитальные мягкие ткани ножницами роговицы, чтобы идеально изолировать глазное яблоко.
   3. Подготовьте 96-луночную пластину с расплавленным воском внутри. Быстро создайте круглое отверстие с помощью кончиков щипцов, а затем дождитесь застывания.
4. Подготовьте среду к тестированию: 0,5% mACS, 0,5% AS для сравнения, нормальный физиологический раствор в качестве отрицательного контроля и модифицированная среда Дульбекко Игла (DMEM).
   ПРИМЕЧАНИЕ: mACS получается с использованием протокола, упомянутого выше.
5. Для культуры ex vivo поместите собранное глазное яблоко на подготовленную тарелку с 96 лунками. Добавьте 200 мкл каждой среды в 96-луночную пластину.
6. Поместите культуральную пластину с 96 лунками в инкубатор при температуре 37 °C с содержанием_CO2 5%. Следите за тем, чтобы питательные среды менялись каждые 24 часа.
7. Для подтверждения последовательного ранозаживляющего эффекта контролируют область эпителиальной раны под микроскопом каждые 8 ч путем окрашивания флуоресцеином.
   1. Растворите флуоресцеин на флуоресцеиновой бумаге обычным физиологическим раствором.
   2. Капните флуоресцеиновый краситель на центральную роговицу мыши, затем наблюдайте и документируйте его под микроскопом. Типичный результат показан на рисунке 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения достаточно одной капли (примерно 0,05 мл) флуоресцеинового красителя.

Результаты

На рисунках 1 и 2 показаны материалы, необходимые для эксперимента, а на рисунке 3 показаны последовательные этапы и успешные промежуточные продукты во время подготовки mACS. Сначала 0,5 мл 10% раствора глицерина добавляли в каждую стерильную ?...

Обсуждение

В этом исследовании описан протокол приготовления mACS и дополнительно показана польза глазных капель mACS для заживления ран на животных моделях. Важнейшей модификацией этого протокола mACS является добавление приблизительно 0,5 мл 10% раствора глицерина в каждую пробирку, что создает подхо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004