Produzione di siero autologo condizionato modificato e valutazione ex vivo del suo potenziale cicatrizzante nell'epitelio corneale murino

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per semplificare il processo e rendere meno costosa la preparazione del siero autologo condizionato (ACS). Non sono necessarie siringhe speciali o perle di vetro rivestite in superficie. Inoltre, l'ACS modificato (mACS) ha vantaggi competitivi rispetto al siero autologo convenzionale nella guarigione della ferita corneale degli occhi murini ex vivo.

Abstract

Le terapie topiche derivate dal sangue umano sono state un vantaggio per i medici negli ultimi decenni. Il siero autologo (AS) e il plasma ricco di piastrine (PRP) sono arricchiti in fattori di crescita epiteliotropici essenziali nella guarigione delle ferite corneali. A differenza dell'AS, il PRP si basa su un sistema di centrifugazione differenziale, producendo più fattori di crescita derivati dalle piastrine. Il siero autologo condizionato (ACS) non solo preserva la preparazione di AS e PRP, ma si concentra anche sulle proprietà immunomodulanti, che sono importanti nelle malattie infiammatorie.

La mancanza di protocolli standardizzati e gli elevati costi di preparazione sono limitazioni per l'applicazione clinica di ACS. Questo esperimento video dimostra una procedura operativa standard per la preparazione di colliri a siero autologo condizionato modificato (mACS). In primo luogo, il glicerolo è stato aggiunto nelle siringhe di eparina come stabilizzatore delle cellule del sangue durante l'incubazione ipossica. Per attivare le cellule del sangue, è stata avviata un'incubazione di 4 ore a 37 °C. Quindi, i campioni di sangue sono stati centrifugati a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la filtrazione del surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm, i colliri mACS sono stati completamente preparati.

Un tentativo di prova dell'effetto terapeutico del mACS ha dimostrato che può avere vantaggi competitivi rispetto alla SA convenzionale nella guarigione della ferita corneale negli occhi di topo ex vivo . L'AS utilizzato in questo studio è stato preparato in base agli studi pubblicati e alla pratica clinica nel nostro ospedale. Pertanto, l'efficacia del mACS sulle malattie della superficie oculare potrebbe essere valutata nella ricerca futura attraverso studi in vivo sugli animali e studi clinici.

Introduzione

Gli effetti terapeutici del siero autologo (AS) nelle malattie dell'occhio secco sono stati segnalati per la prima volta nel 1980 da Fox et ^al.1. Si ritiene che sia la proprietà lubrificante che i componenti biochimici epiteliotropici essenziali nell'AS, imitando le lacrime naturali, favoriscano la proliferazione delle cellule epiteliali corneali. Negli ultimi decenni, diversi studi sono stati eseguiti su questa base. I componenti trofici includono il fattore di crescita epidermico (EGF), la vitamina A, il fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e altre citochine. È interessante notare che il siero è ricco di TGF- β e vitamina A, che si ritiene svolgano un ruolo fondamentale nella proliferazione epidermica 2,3,4,5. Inoltre, nel trattamento di pazienti con malattie della superficie oculare, diversi studi hanno mostrato alcuni vantaggi del collirio AS negli esiti riferiti dai pazienti, altri parametri oggettivi dell'occhio secco ^6,7 e risultati microscopici come la densità cellulare⁸. Gli studi di meta-analisi hanno rivelato che potrebbero esserci alcuni benefici nel migliorare le sindromi del paziente con il trattamento con collirio AS, ma mancano ancora risultati e osservazioni a lungo termine ^9,10.

A differenza dell'AS, il plasma ricco di piastrine (PRP) deriva dall'aggiunta di un anticoagulante durante la preparazione, con ulteriore centrifugazione differenziale e attivazione chimica delle piastrine. Rispetto all'AS, numerose sostanze chimiche e fattori di crescita, come TGF-β, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) ed EGF, sono presenti nel PRP. È stato anche applicato alle malattie della superficie oculare con benefici clinici nel sollievo dai sintomi¹¹.

Il legame incrociato tra difetti epiteliali e infiammazione è complesso. In particolare, l'immunofisiopatologia è un altro problema importante nelle malattie della superficie oculare. Si ritiene che le citochine pro-infiammatorie, come IL-1β e IFN-γ, siano mediatori cardine nelle cascate infiammatorie¹². Si aprono così nuove vie di trattamento basate sulla comprensione del meccanismo immunitario. Le strategie per fermare questo processo infiammatorio, compresa la produzione di antagonisti del recettore dell'interleuchina-1 (IL-1Ra) e altre citochine antinfiammatorie, possono anche svolgere un ruolo importante nelle malattie della superficie oculare^13,14,15.

Dal 1998, Orthokine, un siero autologo condizionato commercializzato (ACS), è stato utilizzato clinicamente in pazienti ortopedici affetti da osteoartrite (OA), artrite reumatoide (RA) e disturbi spinali¹³. Rispetto a AS e PRP, il trattamento con perle di vetro rivestite chimicamente e l'incubazione ipossica per attivare i monociti sono le caratteristiche specifiche di ACS¹⁶. Teoricamente, più fattori anti-infiammatori possono essere secreti aggiungendo stress di sopravvivenza alle cellule, con conseguente maggiore concentrazione di componenti immunomodulanti essenziali, tra cui IL-1Ra. Sono stati riportati anche i migliori benefici terapeutici dell'ACS nell'OA, rispetto all'AS,¹⁷. Le malattie della superficie oculare condividono sfondi immunitari simili con le malattie infiammatorie ortopediche per alcuni aspetti. Pertanto, sulla base dei risultati positivi della terapia derivata dal sangue umano in campo ortopedico, l'ACS potrebbe avere vantaggi rispetto ai trattamenti convenzionali nella pratica clinica dalle proprietà epiteliotropiche e immunomodulanti. Sebbene l'ACS sia stato ampiamente utilizzato nelle malattie infiammatorie ortopediche, le sue applicazioni cliniche in oftalmologia devono ancora essere esplorate, il che può essere ostacolato dal suo costo elevato, dalla mancanza di supporto della letteratura e dalla mancanza di standardizzazione del processo di preparazione, con conseguente prestazioni diverse.

In questo articolo video, è stato dimostrato un metodo nuovo, economico e conveniente per generare l'ACS modificato (mACS), o plasma ricco di fattori di crescita (PRGF), producendo una soluzione colliria con un valore pratico comparabile agli ACS commercializzati. Le idee chiave di aggiungere anticoagulanti e innescare le cellule del sangue per secernere citochine antinfiammatorie mediante incubazione stressata sono state mantenute, ma a differenza dei metodi indotti chimicamente, come quelli basati su perle di vetro rivestite di CrSO₄ e kit commerciali, lo stato di stress critico è fisicamente indotto dall'incubazione ipossica in questo metodo. Inoltre, il glicerolo è stato aggiunto per fornire ulteriori benefici, tra cui un aumento della stabilità della membrana delle cellule del sangue, il mantenimento di una corretta pressione del fluido extracellulare osmotico¹⁸ e un'appropriata fonte di nutrienti in condizioni ipossiche che evitano di sovraccaricare le cellule.

Protocollo

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali all'inizio della sezione protocollo. Tutti i protocolli e le procedure sono stati eseguiti secondo la Dichiarazione di Helsinki e sono stati esaminati e approvati dal Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Tutti i volontari sono stati informati della natura di questo studio e hanno firmato un modulo di consenso informato prima della loro inclusione. I materiali di consumo richiesti per l'intera procedura sperimentale sono presentati in Figura 1 e Figura 2, nonché nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei materiali necessari per produrre colliri mACS

1. Preparare 250 ml di soluzione di glicerolo al 10% e tenere a portata di mano un set per infusione con ali di farfalla da 21 G, una siringa da 3 ml senza ago e sei provette vacutainer da 10 mL contenenti eparina 158 unità USP pronte (Figura 1).
2. Collegare l'ago per la raccolta del sangue da 21 G alla siringa da 3 ml e prelevare 3 ml di soluzione di glicerolo al 10% nella siringa preparata.
   NOTA: Tutti i materiali devono essere sterilizzati prima dell'inserimento dell'ago.
3. Distribuire la soluzione di glicerolo al 10% nelle provette di vacutainer in sequenza, con circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna (Figura 3A).
   NOTA: A causa della pressione negativa nella provetta, l'ago deve uscire immediatamente dopo essere entrato per distribuire uniformemente 3 ml di soluzione di glicerolo alle sei provette.
4. Sterilizzare la pelle del paziente con tamponi di cotone sterili al 75% di alcol. Forare la vena superficiale degli arti superiori del paziente con l'ago per la raccolta del sangue da 18 G. Prelevare 60-70 ml di sangue venoso dalla vena superficiale in totale.

2. Preparazione per collirio mACS

1. Iniettare sequenzialmente 10 ml di sangue venoso prelevato in ciascuna delle sei provette vacutainer (Figura 3B).
   NOTA: Questo passaggio si basa sulla pressione negativa del vuoto per riempire i tubi. Per evitare la rottura delle cellule del sangue e l'emolisi, non applicare alcuna pressione positiva.
2. Collocare i sei tubi vacutainer nell'incubatore con una temperatura costante di 37 °C per 4 ore (figura 3C).
   NOTA: Lo stato ipossico è mantenuto e stabilizzato dalla pressione negativa rimanente in un tubo sigillato che ha ricevuto glicerolo.
3. Rimuovere i tubi dall'incubatore dopo 4 ore e centrifugarli a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. A questo punto, preparare i materiali per l'estrazione di mACS, compresi i flaconi di collirio sterilizzati, una siringa da 3 ml con l'ago, un filtro da 0,22 μm, un ago da 18 G e un paio di guanti sterili (Figura 2).
   NOTA: il tavolo operatorio deve essere pulito con alcool al 75% per garantire un ambiente asettico. Il surnatante, dopo centrifugazione, è già un semilavorato di mACS.
5. Posizionare i sei tubi sulla cremagliera e aprire i tappi dopo la centrifugazione completa (Figura 3D).
   NOTA: la sterilità non è richiesta in questo passaggio.
6. Indossare guanti sterili ed estrarre il mACS uno per uno usando una siringa da 3 mL con un ago da 18 G.
   NOTA: Fare attenzione a non disegnare lo strato inferiore di cellule del sangue durante questo passaggio (Figura 3E).
7. Estrarre l'ago, collegarlo al filtro da 0,22 μm e collegare l'ago per la raccolta del sangue da 23 G, 1,5 pollici con la siringa originale da 3 ml all'uscita sottostante (Figura 3F).
8. Spingere delicatamente l'ago attraverso il filtro da 0,22 μm nei flaconi sterili di collirio preparati (Figura 3G).
9. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutto il mACS è stato filtrato e conservato in flaconi di collirio (Figura 3H).
10. Conservare il collirio mACS a 4 °C per un uso immediato; conservare a -20 °C per una conservazione a lungo termine.
    NOTA: Non conservarli per più di 2 settimane a 4 °C o per più di 3 mesi a -20 °C ^9,19.

3. Modello di guarigione ex vivo dell'epitelio corneale murino

NOTA: Il seguente modello animale ex vivo era basato sulla precedente esperienza di Hung et al. sulle lesioni meccaniche dell'epitelio corneale²⁰. I seguenti passaggi devono essere eseguiti al microscopio per creare una ferita epiteliale corneale ben circoscritta e coerente.

1. Anestetizzare i topi C57BL/6 con isoflurano al 3%-4%. Rientrare il pugno della biopsia cutanea sulla cornea centrale murina, lasciando un cerchio poco profondo sull'epitelio come margine uniforme della ferita.
   NOTA: Sii delicato per evitare la rottura del bulbo oculare.
2. Debride l'epitelio corneale all'interno dell'area confermata fino allo strato di Bowman, con un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale dotato di una bava di 0,5 mm.
3. Per stabilire il modello animale ex vivo della ferita corneale meccanica, raccogliere il bulbo oculare e preparare bene la coltura.
   1. Eutanasia i topi prima; Quindi, premere delicatamente i bordi orbitali superiori e inferiori dei topi, introdurre la punta della pinza sullo spazio retrobulbare, e fuori il bulbo oculare e tenerlo per la pinza.
   2. Tagliare il nervo ottico e il tessuto molle periorbitale con le forbici corneali per isolare perfettamente il bulbo oculare.
   3. Preparare una piastra da 96 pozzetti con cera fusa al suo interno. Creare rapidamente un foro rotondo usando le punte delle pinze e quindi attendere la solidificazione.
4. Preparare i mezzi da testare: 0,5% mACS, 0,5% AS per confronto, soluzione salina normale come controllo negativo e mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
   NOTA: mACS si ottiene utilizzando il protocollo sopra menzionato.
5. Per la coltura ex vivo , posizionare il bulbo oculare raccolto sulla piastra da 96 pozzetti preparata. Aggiungere 200 μL di ciascun mezzo nella piastra a 96 pozzetti.
6. Posizionare la piastra di coltura a 96 pozzetti nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂. Assicurarsi che i terreni di coltura vengano cambiati ogni 24 ore.
7. Per confermare l'effetto sequenziale di guarigione della ferita, monitorare l'area epiteliale della ferita al microscopio ogni 8 ore mediante colorazione con fluoresceina.
   1. Sciogliere la fluoresceina sulla carta fluoresceina con soluzione salina normale.
   2. Lascia cadere il colorante alla fluoresceina sulla cornea centrale murina, quindi osservalo e documentalo al microscopio. Un risultato tipico è illustrato nella Figura 4.
      NOTA: Una goccia (circa 0,05 ml) di colorante fluoresceina è sufficiente per l'osservazione.

Risultati

La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i materiali necessari per l'esperimento, mentre la Figura 3 mostra le fasi sequenziali e i prodotti intermedi di successo durante la preparazione del mACS. In primo luogo, 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% sono stati aggiunti in ogni provetta sterile da 10 ml (Figura 3A). Quindi, 60-70 ml di sangue venoso sono stati ottenuti dal paziente e 10 ml di sangue sono st...

Discussione

In questo studio, viene descritto un protocollo per la preparazione di mACS e viene ulteriormente dimostrato il beneficio del collirio mACS nella guarigione delle ferite dei modelli animali. La modifica cruciale di questo protocollo mACS è l'aggiunta di circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna provetta, che crea condizioni ipossiche adeguate durante l'incubazione di 4 ore a 37 °C. Questa impostazione fornisce all'AS uno stress adeguato e sollecita le cellule a secernere i fattori di crescita necessari...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004