ייצור סרום מותנה אוטולוגי מותאם והערכת Ex Vivo של פוטנציאל הריפוי שלו באפיתל הקרנית

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לפשט את התהליך ולהפוך את הכנת סרום מותנה אוטולוגי (ACS) לפחות יקר. אין צורך במזרקים מיוחדים או בחרוזי זכוכית מצופים פני שטח. יתר על כן, ACS שונה (mACS) יש יתרונות תחרותיים על פני סרום אוטולוגי קונבנציונאלי ריפוי פצע הקרנית של העיניים murine ex vivo.

Abstract

טיפולים מקומיים שמקורם בדם אנושי היו ברכה לרופאים בעשורים האחרונים. סרום אוטולוגי (AS) ופלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מועשרים בגורמי גדילה אפיתליאוטרופיים החיוניים לריפוי פצעים בקרנית. בניגוד ל-AS, PRP מבוסס על מערכת צנטריפוגות דיפרנציאלית, המניבה יותר גורמי גדילה שמקורם בטסיות. סרום אוטולוגי מותנה (ACS) לא רק משמר את הכנת AS ו- PRP, אלא גם מתמקד בתכונות מווסתות חיסון, החשובות במחלות דלקתיות.

היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים ועלויות הכנה גבוהות הם מגבלות ליישום קליני של ACS. ניסוי וידאו זה מדגים הליך הפעלה סטנדרטי להכנת טיפות עיניים מסוג סרום מותנה אוטולוגי (mACS). ראשית, גליצרול נוסף למזרקי הפרין כמייצב תאי הדם במהלך דגירה היפוקסית. כדי להפעיל את תאי הדם, החלה דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגימות הדם היו צנטריפוגות ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סינון הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר, טיפות העיניים mACS הוכנו במלואן.

ניסוי טנטטיבי של ההשפעה הטיפולית של mACS הראה כי עשויים להיות לו יתרונות תחרותיים על פני AS קונבנציונלי בריפוי פצע הקרנית בעיני עכבר ex vivo . ה- AS המשמש במחקר זה הוכן על פי מחקרים שפורסמו והפרקטיקה הקלינית בבית החולים שלנו. לכן, ניתן להעריך את היעילות של mACS על מחלות פני השטח של העין במחקר עתידי באמצעות מחקרים בבעלי חיים in vivo וניסויים קליניים.

Introduction

ההשפעות הטיפוליות של סרום אוטולוגי (AS) במחלות עיניים יבשות דווחו לראשונה בשנות השמונים על ידי פוקס ^{ואחרים1.} הוא האמין כי הן את תכונת סיכה ואת המרכיבים הביוכימיים epitheliotropic חיוני AS, מחקה דמעות טבעיות, לטובת התפשטות של תאי אפיתל הקרנית. במהלך העשורים האחרונים בוצעו מספר מחקרים על בסיס זה. מרכיבים טרופיים כוללים גורם גדילה אפידרמיס (EGF), ויטמין A, גורם גדילה טרנספורמטיבי β (TGF- β), וציטוקינים אחרים. באופן מעניין, הסרום עשיר ב-TGF-β ובוויטמין A, אשר מאמינים כי יש להם תפקיד מרכזי בהתפשטות האפידרמיס 2,3,4,5. בנוסף, כאשר מטפלים בחולים עם מחלות פני העין, מספר מחקרים הראו כמה יתרונות של טיפות עיניים AS בתוצאות המדווחות על ידי המטופלים, פרמטרים אובייקטיביים אחרים של עין יבשה ^6,7, וממצאים מיקרוסקופיים כגון צפיפות תאים⁸. מחקרי מטא-אנליזה גילו כי עשויים להיות כמה יתרונות בשיפור תסמונות המטופל עם טיפול בטיפות עיניים AS, אך תוצאות ותצפיות ארוכות טווח עדיין חסרות ^9,10.

שלא כמו AS, פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) נגזרת מהוספת נוגד קרישה במהלך ההכנה, עם צנטריפוגה דיפרנציאלית נוספת והפעלה כימית של טסיות הדם. בהשוואה ל- AS, כימיקלים וגורמי גדילה רבים, כגון TGF- β, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) ו- EGF, נמצאים ב- PRP. זה כבר מיושם גם על מחלות פני השטח של העין עם יתרונות קליניים בהקלה על סימפטומים¹¹.

הקשר הצולב, בין פגמים אפיתליאליים לדלקת, הוא מורכב. יש לציין כי אימונופתופיזיולוגיה היא נושא חשוב נוסף במחלות פני העין. מאמינים כי ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון IL-1β ו-IFN-γ, הם מתווכים מרכזיים במפל דלקתי¹². כך נפתחים אפיקי טיפול חדשים המבוססים על הבנת מנגנון החיסון. אסטרטגיות לעצור את התהליך הדלקתי הזה, כולל ייצור אנטגוניסט קולטן אינטרלוקין-1 (IL-1Ra) וציטוקינים אנטי דלקתיים אחרים, עשויות גם לשחק תפקיד חשוב במחלות פני השטח של העין^13,14,15.

מאז 1998, אורתוקין, סרום אוטולוגי מותנה מסחרי (ACS), נמצא בשימוש קליני בחולים אורתופדיים הסובלים מאוסטאוארתריטיס (OA), דלקת מפרקים שגרונית (RA) והפרעות בעמוד השדרה¹³. בהשוואה ל- AS ו- PRP, טיפול בחרוזי זכוכית מצופים כימית ודגירה היפוקסית להפעלת מונוציטים הם התכונות הספציפיות של ACS¹⁶. תיאורטית, ניתן להפריש יותר גורמים אנטי דלקתיים על-ידי הוספת עקה הישרדותית לתאים, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של רכיבים חיוניים המווסתים את מערכת החיסון, כולל IL-1Ra. היתרונות הטיפוליים המשופרים של ACS ב- OA, בהשוואה ל- AS, דווחו גם הם¹⁷. מחלות פני השטח של העין חולקות רקע חיסוני דומה עם מחלות דלקתיות אורתופדיות במובנים מסוימים. לכן, בהתבסס על התוצאות המוצלחות של טיפול שמקורו בדם אנושי בתחום האורתופדי, ACS עשוי להיות בעל יתרונות על פני טיפולים קונבנציונליים בקליניקה על ידי תכונות אפיתליאוטרופיות ומווסתות חיסון. למרות ACS כבר בשימוש נרחב במחלות דלקתיות אורתופדיות, היישומים הקליניים שלה ברפואת עיניים עדיין צריך להיחקר, אשר עשוי להיות מעוכב על ידי העלות הגבוהה שלה, חוסר תמיכה ספרותית, וחוסר סטנדרטיזציה של תהליך ההכנה, וכתוצאה מכך ביצועים מגוונים.

במאמר וידאו זה, הודגמה שיטה חדשנית, חסכונית ונוחה ליצירת ACS שונה (mACS), או פלזמה עשירה בגורמי גדילה (PRGF), המייצרת פתרון טיפות עיניים עם ערך מעשי דומה ל- ACS ממוסחר. רעיונות המפתח של הוספת נוגדי קרישה והפעלת תאי הדם להפריש ציטוקינים אנטי דלקתיים על ידי דגירה בלחץ נשמרו, אך בניגוד לשיטות המושרות כימית, כגון אלה המבוססות על חרוזי זכוכית מצופים CrSO₄ וערכות מסחריות, מצב הלחץ הקריטי נגרם פיזית על ידי דגירה היפוקסית בשיטה זו. יתר על כן, גליצרול נוסף כדי לספק יתרונות נוספים, כולל עלייה ביציבות הממברנה של תאי הדם, שמירה על לחץ נוזל חוץ תאי אוסמוטי תקין¹⁸, ומקור מתאים של חומרים מזינים בתנאים היפוקסיים המונעים עומס יתר על התאים.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות בתחילת פרק הפרוטוקול. כל הפרוטוקולים והנהלים בוצעו על פי הצהרת הלסינקי ונבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של הקרן הרפואית צ'אנג גונג. כל המתנדבים קיבלו מידע על אופי המחקר וחתמו על טופס הסכמה מדעת לפני הכללתם. החומרים המתכלים הדרושים לכל הליך הניסוי מוצגים באיור 1 ובאיור 2, כמו גם בטבלת החומרים.

1. הכנת החומרים הדרושים לייצור טיפות עיניים mACS

1. הכינו 250 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% והחזיקו ערכת עירוי 21 גרם כנפי פרפר, מזרק 3 מ"ל ללא המחט, ושישה צינורות vacutainer 10 מ"ל המכילים הפרין 158 יחידות USP מוכנות (איור 1).
2. חבר את מחט איסוף הדם 21 גרם למזרק 3 מ"ל ומשוך 3 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% לתוך המזרק המוכן.
   הערה: יש לעקר את כל החומרים לפני החדרת המחט.
3. פזרו את תמיסת הגליצרול 10% לתוך צינורות הוואקוטאיינר ברצף, עם כ-0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% בכל אחד מהם (איור 3A).
   הערה: בגלל הלחץ השלילי במבחנה, המחט חייבת לצאת מיד לאחר שהיא נכנסת כדי להפיץ באופן שווה 3 מ"ל של תמיסת גליצרול לשש המבחנות.
4. לעקר את העור של המטופל עם 75% אלכוהול צמר גפן סטרילי. לנקב את הווריד השטחי של הגפיים העליונות של המטופל עם מחט איסוף הדם 18 G. צייר 60-70 מ"ל של דם ורידי מן הווריד השטחי בסך הכל.

2. הכנה לטיפות עיניים mACS

1. הזריקו ברצף 10 מ"ל של הדם הוורידי הנשאב לתוך כל אחד מששת צינורות ה-vacutainer (איור 3B).
   הערה: שלב זה מסתמך על הלחץ השלילי של הוואקום כדי למלא את הצינורות. כדי למנוע הפרעה לתאי הדם והמוליזה, אין להפעיל לחץ חיובי.
2. הניחו את ששת צינורות הוואקוטיינר באינקובטור עם טמפרטורה קבועה של 37°C למשך 4 שעות (איור 3C).
   הערה: המצב ההיפוקסי נשמר ומיוצב על ידי הלחץ השלילי שנותר בצינור אטום שקיבל גליצרול.
3. מוציאים את הצינורות מהאינקובטור לאחר 4 שעות וצנטריפוגות אותם ב-3,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. בשלב זה, הכינו את החומרים למיצוי mACS, כולל בקבוקי טיפות עיניים מעוקרים, מזרק 3 מ"ל עם המחט, מסנן 0.22 מיקרומטר, מחט 18 גרם וזוג כפפות סטריליות (איור 2).
   הערה: יש לנגב את שולחן הניתוחים עם 75% אלכוהול כדי להבטיח סביבה אספטית. הסופרנטנט, אחרי הצנטריפוגה, הוא כבר מוצר חצי מוגמר של mACS.
5. הניחו את ששת הצינורות על מדף הצינור ופתחו את הפקקים לאחר צנטריפוגה מלאה (איור 3D).
   הערה: עקרות אינה נדרשת בשלב זה.
6. שים כפפות סטריליות ולשלוף את mACS אחד אחד באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 18 גרם.
   הערה: היזהרו לא למשוך את שכבת תאי הדם התחתונה במהלך השלב הזה (איור 3E).
7. משכו את המחט, חברו אותה למסנן של 0.22 מיקרומטר, וחברו את מחט איסוף הדם 23 G, 1.5 אינץ' עם מזרק 3 מ"ל המקורי לשקע למטה (איור 3F).
8. דחפו את המחט בעדינות דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוקי טיפות העיניים הסטריליים המוכנים (איור 3G).
9. חזרו על השלבים לעיל עד שכל ה-mACS יסונן ויאוחסן בבקבוקי טיפות עיניים (איור 3H).
10. יש לאחסן את טיפות העיניים mACS בטמפרטורה של 4°C לשימוש מיידי; יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לשימור לטווח ארוך.
    הערה: אין לשמור אותם במשך יותר משבועיים ב 4 ° C או במשך יותר מ 3 חודשים ב -20 ° C ^9,19.

3. מודל ריפוי פצע Ex vivo של אפיתל הקרנית מורין

הערה: המודל הבא של בעלי חיים ex vivo התבסס על ניסיון קודם של Hung et al. על פציעות מכניות של אפיתל הקרנית²⁰. את השלבים הבאים יש לבצע תחת המיקרוסקופ כדי ליצור פצע אפיתל קרנית מוגבל היטב ועקבי.

1. מרדימים עכברי C57BL/6 עם איזופלורן 3%-4%. הכניסו פנימה את אגרוף ביופסיית העור מעל הקרנית המרכזית של מורין, והותירו עיגול רדוד על האפיתל כשולי פצע אחידים.
   הערה: היו עדינים כדי למנוע קרע בגלגל העין.
2. יש להוריד את אפיתל הקרנית בתוך האזור המאושר עד לשכבת באומן, בעזרת מסיר טבעת חלודה בקרנית המצויד בבור בקוטר 0.5 מ"מ.
3. כדי לבסס את מודל בעלי החיים ex vivo של פצע הקרנית מכני, לקצור את גלגל העין ולהכין את התרבות היטב.
   1. להרדים תחילה את העכברים; לאחר מכן, לחץ בעדינות על שולי המסלול העליונים והנחותים של העכברים, הכנס את קצה המלקחיים מעל חלל הרטרובולבר, והחוצה את גלגל העין והחזק אותו במלקחיים.
   2. חותכים את עצב הראייה ואת הרקמה הרכה periorbital עם מספריים הקרנית כדי לבודד את גלגל העין בצורה מושלמת.
   3. מכינים צלחת 96 בארות עם שעווה מומסת בתוכה. צור במהירות חור עגול באמצעות קצות המלקחיים ולאחר מכן המתן להתמצקות.
4. הכינו את המדיה לבדיקה: 0.5% mACS, 0.5% AS להשוואה, מי מלח רגילים כבקרה שלילית, ותווך הנשר המותאם של דולבקו (DMEM).
   הערה: mACS מתקבל באמצעות הפרוטוקול שהוזכר לעיל.
5. לתרבות ex vivo , הניחו את גלגל העין שנקטף על צלחת מוכנה בת 96 בארות. הוסף 200 μL של כל מדיום לתוך צלחת 96 בארות.
6. הכניסו את צלחת התרבית בת 96 הקידוחים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂. ודא כי מדיה תרבותית משתנה כל 24 שעות.
7. כדי לאשר את אפקט ריפוי הפצע הרציף, עקוב אחר אזור פצע האפיתל מתחת למיקרוסקופ כל 8 שעות על ידי צביעת פלואורסצאין.
   1. ממיסים את הפלואורסצאין על נייר הפלואורסצאין במי מלח רגילים.
   2. זרקו את הצבע הפלואורסצאין על הקרנית המרכזית של המורין, ואז התבוננו ותיעדו אותו במיקרוסקופ. תוצאה אופיינית מוצגת באיור 4.
      הערה: טיפה אחת (כ-0.05 מ"ל) של צבע פלואורסצאין מספיקה לתצפית.

תוצאות

איור 1 ואיור 2 מראים את החומרים הדרושים לניסוי, ואיור 3 מציג את השלבים הרציפים ואת תוצרי הביניים המוצלחים במהלך הכנת mACS. ראשית, 0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% נוספה לכל מבחנה סטרילית של 10 מ"ל (איור 3A). לאחר מכן, 60-70 מ"ל של דם ורידי התקבל?...

Discussion

במחקר זה, פרוטוקול להכנת mACS מתואר והיתרון של טיפות עיניים mACS בריפוי פצעים של מודלים של בעלי חיים מוצג עוד יותר. השינוי המכריע של פרוטוקול mACS זה הוא תוספת של כ -0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% בכל מבחנה, היוצרת תנאים היפוקסיים מתאימים במהלך הדגירה של 4 שעות ב -37 מעלות צלזיוס. הגדרה זו מספקת ל- AS מתח מת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004