Modifiye Otolog Şartlandırılmış Serum Üretimi ve Murin Kornea Epitelinde İyileşme Potansiyelinin Ex Vivo Değerlendirilmesi

Özet

Bu makalede, süreci basitleştirmek ve otolog şartlandırılmış serum (AKS) hazırlanmasını daha ucuz hale getirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Özel şırıngalara veya yüzey kaplamalı cam boncuklara gerek yoktur. Ayrıca, modifiye ACS (mACS), murin gözlerin ex vivo kornea yara iyileşmesinde konvansiyonel otolog seruma göre rekabet avantajına sahiptir.

Özet

İnsan kanından türetilen topikal tedaviler son yıllarda klinisyenler için bir nimet olmuştur. Otolog serum (AS) ve trombositten zengin plazma (PRP), kornea yara iyileşmesinde önemli olan epitelyotropik büyüme faktörleri açısından zenginleştirilmiştir. AS'den farklı olarak PRP, daha fazla trombosit kaynaklı büyüme faktörü sağlayan diferansiyel bir santrifüjleme sistemine dayanır. Otolog şartlandırılmış serum (AKS) sadece AS ve PRP'nin hazırlanmasını korumakla kalmaz, aynı zamanda enflamatuar hastalıklarda önemli olan bağışıklık modüle edici özelliklere de odaklanır.

Standartlaştırılmış protokollerin eksikliği ve yüksek hazırlık maliyetleri, AKS'nin klinik uygulaması için sınırlamalardır. Bu video deneyi, modifiye otolog koşullu serum (mACS) göz damlası hazırlamak için standart bir çalışma prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, hipoksik inkübasyon sırasında kan hücresi stabilizatörü olarak heparin şırıngalarına gliserol eklendi. Kan hücrelerini aktive etmek için, 37 ° C'de 4 saatlik bir inkübasyon başlatıldı. Daha sonra, kan örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.500 × g'da santrifüj edildi. Süpernatantın 0.22 μm'lik bir filtreden filtrelenmesinden sonra, mACS göz damlaları tamamen hazırlandı.

mACS'nin terapötik etkisinin geçici bir denemesi, ex vivo fare gözlerinde kornea yara iyileşmesinde geleneksel AS'ye göre rekabet avantajlarına sahip olabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan AS, yayınlanan çalışmalara ve hastanemizdeki klinik uygulamaya göre hazırlanmıştır. Bu nedenle, mACS'nin oküler yüzey hastalıkları üzerindeki etkinliği, in vivo hayvan çalışmaları ve klinik çalışmalar yoluyla gelecekteki araştırmalarda değerlendirilebilir.

Giriş

Kuru göz hastalıklarında otolog serumun (AS) terapötik etkileri ilk olarak 1980'lerde Fox ve ^ark.1 tarafından bildirilmiştir. Hem yağlama özelliğinin hem de AS'deki doğal gözyaşlarını taklit eden temel epitelyotropik biyokimyasal bileşenlerin kornea epitel hücrelerinin çoğalmasına fayda sağladığına inanılmaktadır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, bu temelde çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Trofik bileşenler epidermal büyüme faktörü (EGF), A vitamini, dönüştürücü büyüme faktörü β (TGF-β) ve diğer sitokinleri içerir. İlginç bir şekilde, serum, epidermal proliferasyonda önemli bir rol oynadığına inanılan TGF- β ve A vitamini bakımından zengindir ^2,3,4,5. Ek olarak, oküler yüzey hastalıkları olan hastaları tedavi ederken, çeşitli çalışmalar AS göz damlalarının hasta tarafından bildirilen sonuçlarda, diğer objektif kuru göz parametrelerinde ^6,7 ve hücre yoğunluğu⁸ gibi mikroskobik bulgularda bazı avantajları olduğunu göstermiştir. Meta-analiz çalışmaları, AS göz damlası tedavisi ile hasta sendromlarının iyileştirilmesinde bazı faydalar olabileceğini ortaya koymuştur, ancak uzun vadeli sonuçlar ve gözlemler hala ^9,10'dan yoksundur.

AS'den farklı olarak, trombositten zengin plazma (PRP), trombositlerin daha fazla diferansiyel santrifüjlenmesi ve kimyasal aktivasyonu ile hazırlık sırasında bir antikoagülan eklenmesinden elde edilir. AS ile karşılaştırıldığında, PRP'de TGF-β, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve EGF gibi çok sayıda kimyasal madde ve büyüme faktörü mevcuttur. Ayrıca semptom hafifletmede klinik yararları olan oküler yüzey hastalıklarına da uygulanmıştır¹¹.

Epitel defektleri ve inflamasyon arasındaki çapraz bağlantı karmaşıktır. Özellikle immünopatofizyoloji oküler yüzey hastalıklarında bir diğer önemli konudur. IL-1β ve IFN-γ gibi pro-inflamatuar sitokinlerin, inflamatuar kaskadlar^12'de pivotal mediatörler olduğuna inanılmaktadır. Böylece bağışıklık mekanizmasının anlaşılmasına dayalı yeni tedavi yolları açılır. İnterlökin-1 reseptör antagonisti (IL-1Ra) ve diğer anti-enflamatuar sitokinlerin üretimi de dahil olmak üzere bu enflamatuar süreci durdurma stratejileri de oküler yüzey hastalıklarında önemli bir rol oynayabilir^13,14,15.

1998 yılından bu yana, ticarileştirilmiş otolog şartlandırılmış serum (AKS) olan Orthokin, osteoartrit (OA), romatoid artrit (RA) ve omurga rahatsızlıklarından muzdarip ortopedik hastalarda klinik olarak kullanılmaktadır¹³. AS ve PRP ile karşılaştırıldığında, kimyasal olarak kaplanmış cam boncuklarla muamele ve monositleri aktive etmek için hipoksik inkübasyon ACS^16'nın spesifik özellikleridir. Teorik olarak, hücrelere hayatta kalma stresi eklenerek daha fazla anti-enflamatuar faktör salgılanabilir, bu da IL-1Ra dahil olmak üzere esansiyel bağışıklık modüle edici bileşenlerin daha yüksek konsantrasyonuna neden olur. OA'da AKS'nin AS ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş terapötik yararları da bildirilmiştir¹⁷. Oküler yüzey hastalıkları, bazı açılardan ortopedik inflamatuar hastalıklarla benzer bağışıklık geçmişlerini paylaşır. Bu nedenle, ortopedik alanda insan kanından türetilmiş tedavinin başarılı sonuçlarına dayanarak, AKS'nin epitelyotropik ve immün modüle edici özellikleri ile klinik pratikte konvansiyonel tedavilere göre avantajları olabilir. AKS, ortopedik inflamatuar hastalıklarda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, oftalmolojideki klinik uygulamalarının hala araştırılması gerekmektedir, bu da yüksek maliyeti, literatür desteğinin eksikliği ve hazırlık sürecinin standardizasyonunun olmaması nedeniyle engellenebilir ve bu da farklı performanslara neden olabilir.

Bu video makalesinde, modifiye ACS'yi (mACS) veya büyüme faktörleri bakımından zengin plazmayı (PRGF) üretmek için yeni, uygun maliyetli ve kullanışlı bir yöntem gösterildi ve ticarileştirilmiş ACS'lerle karşılaştırılabilir pratik değere sahip bir göz damlası çözeltisi üretildi. Antikoagülanların eklenmesi ve kan hücrelerinin stresli inkübasyon yoluyla anti-enflamatuar sitokinler salgılaması için tetiklenmesi konusundaki temel fikirler korunmuştur, ancak CrSO₄ kaplı cam boncuklara ve ticari kitlere dayananlar gibi kimyasal olarak indüklenen yöntemlerin aksine, kritik stres durumu bu yöntemde hipoksik inkübasyon tarafından fiziksel olarak indüklenir. Ayrıca, kan hücrelerinin zarının stabilitesinde bir artış, uygun bir ozmotik hücre dışı sıvı basıncının^{korunması 18} ve hipoksik koşullarda hücreleri aşırı strese sokmaktan kaçınan uygun bir besin kaynağı da dahil olmak üzere ekstra faydalar sağlamak için gliserol eklenmiştir.

Protokol

Araştırma, protokol bölümünün başında yer alan kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm protokoller ve prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na göre yürütüldü ve Chang Gung Tıp Vakfı Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Tüm gönüllüler bu çalışmanın doğası hakkında bilgilendirildi ve dahil edilmeden önce bilgilendirilmiş bir onam formu imzaladı. Tüm deneysel prosedür için gerekli sarf malzemeleri Şekil 1 ve Şekil 2'de ve ayrıca Malzeme Tablosunda sunulmuştur.

1. mACS göz damlası üretmek için gerekli malzemelerin hazırlanması

1. 250 mL% 10 gliserol çözeltisi hazırlayın ve 21 G kelebek kanatlı infüzyon seti, iğnesiz 3 mL şırınga ve heparin 158 USP ünitesi içeren altı adet 10 mL vakuminer tüpü hazır bulundurun (Şekil 1).
2. 21 G kan toplama iğnesini 3 mL şırıngaya bağlayın ve hazırlanan şırıngaya 3 mL% 10 gliserol çözeltisi çekin.
   NOT: İğne yerleştirilmeden önce tüm malzemeler sterilize edilmelidir.
3. % 10 gliserol çözeltisini, her birinde yaklaşık 0.5 mL% 10 gliserol çözeltisi olacak şekilde vakuminer tüplerine sırayla dağıtın (Şekil 3A).
   NOT: Test tüpündeki negatif basınç nedeniyle, altı test tüpüne 3 mL gliserol çözeltisini eşit olarak dağıtmak için iğne içeri girdikten hemen sonra çıkmalıdır.
4. Hastanın cildini %75 alkollü steril pamuklu çubuklarla sterilize edin. 18 G kan alma iğnesi ile hastanın üst ekstremitelerinin yüzeysel damarını delin. Yüzeysel damardan toplamda 60-70 mL venöz kan alın.

2. mACS göz damlası için hazırlık

1. Çekilen venöz kanın 10 mL'sini altı vakumer tüpün her birine sırayla enjekte edin (Şekil 3B).
   NOT: Bu adım, tüpleri doldurmak için vakumun negatif basıncına dayanır. Kan hücresi bozulmasını ve hemolizi önlemek için, herhangi bir pozitif basınç uygulamayın.
2. Altı vakumlayıcı tüpünü inkübatöre 4 saat boyunca 37 ° C sabit bir sıcaklıkta yerleştirin (Şekil 3C).
   NOT: Hipoksik durum, gliserol alan kapalı bir tüpte kalan negatif basınç ile korunur ve stabilize edilir.
3. Tüpleri 4 saat sonra inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.500 × g'da santrifüj edin.
4. Bu noktada, sterilize edilmiş göz damlası şişeleri, iğneli 3 mL'lik bir şırınga, 0.22 μm filtre, 18 G iğne ve bir çift steril eldiven dahil olmak üzere mACS ekstraksiyonu için malzemeleri hazırlayın (Şekil 2).
   NOT: Aseptik bir ortam sağlamak için ameliyat masası %75 alkol ile silinmelidir. Süpernatant, santrifüjlemeden sonra, zaten mACS'nin yarı mamul bir ürünüdür.
5. Altı tüpü tüp rafına yerleştirin ve tam santrifüjlemeden sonra kapakları açın (Şekil 3D).
   NOT: Bu adımda sterilite gerekli değildir.
6. Steril eldivenler giyin ve 18 G iğneli 3 mL'lik bir şırınga kullanarak mACS'yi tek tek çıkarın.
   NOT: Bu adım sırasında alt kan hücresi tabakasını çizmemeye dikkat edin (Şekil 3E).
7. İğneyi çıkarın, 0.22 μm filtreye bağlayın ve 23 G, 1.5 kan toplama iğnesini orijinal 3 mL şırınga ile aşağıdaki çıkışa bağlayın (Şekil 3F).
8. İğneyi 0,22 μm filtreden yavaşça hazırlanan steril göz damlası şişelerine itin (Şekil 3G).
9. Tüm mACS filtrelenene ve göz damlası şişelerinde saklanana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın (Şekil 3H).
10. Hemen kullanım için mACS göz damlalarını 4 ° C'de saklayın; Uzun süreli koruma için -20 °C'de saklayın.
    NOT: 4 °C'de 2 haftadan fazla veya -20 °C ^9,19'da 3 aydan uzun süre saklamayın.

3. Murin kornea epitelinin Ex vivo yara iyileşme modeli

NOT: Aşağıdaki ex vivo hayvan modeli, kornea epitelinin mekanik yaralanmaları üzerine Hung ve ark.'nın önceki deneyimlerine dayanmaktadır²⁰. İyi sınırlanmış ve tutarlı bir kornea epitel yarası oluşturmak için mikroskop altında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilmelidir.

1. C57BL/6 fareleri %3-%4 izofluran ile uyuşturun. Cilt biyopsisinin murin merkezi kornea üzerine yumruk atması, epitel üzerinde düzgün bir yara marjı olarak sığ bir daire bırakması.
   NOT: Göz küresi yırtılmasını önlemek için nazik olun.
2. Onaylanmış bölgedeki kornea epiteli, 0.5 mm'lik bir çapak ile donatılmış bir kornea pas halkası sökücü ile Bowman tabakasına kadar sürün.
3. Mekanik kornea yarasının ex vivo hayvan modelini oluşturmak için, göz küresini toplayın ve kültürü iyi hazırlayın.
   1. Önce fareleri ötenazi yapın; Daha sonra, farelerin üstün ve alt yörüngesel kenarlarına hafifçe bastırın, forsepsin ucunu retrobulbar boşluğunun üzerine sokun, göz küresini dışarı çıkarın ve forsepsler tarafından tutun.
   2. Göz küresini mükemmel bir şekilde izole etmek için optik siniri ve periorbital yumuşak dokuyu kornea makası ile kesin.
   3. İçinde erimiş balmumu bulunan 96 delikli bir plaka hazırlayın. Forseps uçlarını kullanarak hızlı bir şekilde yuvarlak bir delik oluşturun ve ardından katılaşmayı bekleyin.
4. Test edilecek ortamı hazırlayın: %0,5 mACS, karşılaştırma için %0,5 AS, negatif kontrol olarak normal salin ve Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal ortamı (DMEM).
   NOT: mACS, yukarıda belirtilen protokol kullanılarak elde edilir.
5. Ex vivo kültürü için, hasat edilen göz küresini hazırlanan 96 delikli plakaya yerleştirin. 96 delikli plakaya her ortamdan 200 μL ekleyin.
6. 96 delikli kültür plakasını %5 CO₂ ile 37 °C'de inkübatöre yerleştirin. Kültür ortamının her 24 saatte bir değiştirildiğinden emin olun.
7. Sıralı yara iyileşmesi etkisini doğrulamak için, floresein boyama ile epitel yara alanını mikroskop altında her 8 saatte bir izleyin.
   1. Floreseini floresein kağıdı üzerinde normal salin ile çözün.
   2. Floresein boyasını murin merkezi korneanın üzerine bırakın, ardından mikroskop altında gözlemleyin ve belgeleyin. Tipik bir sonuç Şekil 4'te gösterilmiştir.
      NOT: Gözlem için bir damla (yaklaşık 0,05 mL) floresein boyası yeterlidir.

Sonuçlar

Şekil 1 ve Şekil 2, deney için gerekli malzemeleri gösterir ve Şekil 3, mACS'nin hazırlanması sırasında sıralı adımları ve başarılı ara ürünleri gösterir. İlk olarak, her 10 mL steril test tüpüne 0.5 mL% 10 gliserol çözeltisi eklendi (Şekil 3A). Daha sonra hastadan 60-70 mL venöz kan elde edildi ve her tüpe 10 mL kan enjekte edildi (Şekil 3B). Ha...

Tartışmalar

Bu çalışmada, mACS'nin hazırlanması için bir protokol tarif edilmiş ve mACS göz damlalarının hayvan modellerinin yara iyileşmesindeki yararı daha da gösterilmiştir. Bu mACS protokolünün en önemli modifikasyonu, her test tüpüne yaklaşık 0.5 mL% 10 gliserol çözeltisinin eklenmesidir ve bu da 37 ° C'de 4 saatlik inkübasyon sırasında uygun hipoksik koşullar yaratır. Bu ayar, AS'ye uygun stres sağlar ve hücreleri yara iyileşmesine yardımcı olan gerekli büyüme faktörlerini salgılamaya te?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004