Produção de Soro Autólogo Condicionado Modificado e Avaliação Ex Vivo de seu Potencial de Cicatrização em Epitélio Corneano Murino

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para simplificar o processo e tornar a preparação de soro condicionado autólogo (SCA) menos dispendiosa. Não são necessárias seringas especiais ou contas de vidro revestidas de superfície. Além disso, a SCA modificada (mACS) apresenta vantagens competitivas sobre o soro autólogo convencional na cicatrização de feridas corneanas de olhos murinos ex vivo.

Resumo

As terapias tópicas derivadas do sangue humano têm sido um benefício para os clínicos nas últimas décadas. O soro autólogo (EA) e o plasma rico em plaquetas (PRP) são enriquecidos em fatores de crescimento epiteliotrópicos essenciais na cicatrização de feridas na córnea. Ao contrário da EA, o PRP é baseado em um sistema de centrifugação diferencial, produzindo mais fatores de crescimento derivados de plaquetas. O soro condicionado autólogo (SCA) não só preserva a preparação de EA e PRP, mas também se concentra nas propriedades imunomoduladoras, que são importantes em doenças inflamatórias.

A falta de protocolos padronizados e os altos custos de preparo são limitações para a aplicação clínica das SCA. Este experimento em vídeo demonstra um procedimento operacional padrão para a preparação de colírios de soro condicionado autólogo modificado (mACS). Primeiro, o glicerol foi adicionado às seringas de heparina como estabilizador das células sanguíneas durante a incubação hipóxica. Para ativar as células sanguíneas, iniciou-se incubação de 4 h a 37 °C. Em seguida, as amostras de sangue foram centrifugadas a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente. Após filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm, os colírios mACS foram totalmente preparados.

Uma tentativa de experimentar o efeito terapêutico da mACS mostrou que ela pode ter vantagens competitivas sobre a EA convencional na cicatrização de feridas na córnea em olhos de camundongos ex vivo . A EA utilizada neste estudo foi preparada de acordo com estudos publicados e com a prática clínica em nosso hospital. Portanto, a eficácia da mACS em doenças da superfície ocular poderia ser avaliada em pesquisas futuras através de estudos in vivo em animais e ensaios clínicos.

Introdução

Os efeitos terapêuticos do soro autólogo (EA) nas doenças do olho seco foram relatados pela primeira vez na década de 1980 por Fox et ^al.1. Acredita-se que tanto a propriedade lubrificante quanto os componentes bioquímicos epiteliotrópicos essenciais na EA, mimetizando lágrimas naturais, beneficiem a proliferação de células epiteliais corneanas. Nas últimas décadas, vários estudos têm sido realizados com base nisso. Os componentes tróficos incluem fator de crescimento epidérmico (EGF), vitamina A, fator transformador de crescimento β (TGF-β) e outras citocinas. Curiosamente, o soro é rico em TGF-β e vitamina A, que se acredita desempenharem um papel fundamental na proliferação epidérmica 2,3,4,5. Além disso, no tratamento de pacientes com doenças da superfície ocular, vários estudos têm demonstrado algumas vantagens do colírio de EA nos resultados relatados pelo paciente,^{outros parâmetros objetivos} do olho seco6,7 e achados microscópicos^{, como a densidade} celular8. Estudos de metanálise revelaram que pode haver alguns benefícios na melhora das síndromes dos pacientes com o tratamento com colírios EA, mas ainda faltam resultados e observações a longo prazo ^9,10.

Ao contrário da EA, o plasma rico em plaquetas (PRP) é derivado da adição de um anticoagulante durante a preparação, com posterior centrifugação diferencial e ativação química das plaquetas. Em comparação com a EA, vários produtos químicos e fatores de crescimento, como TGF-β, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e EGF, estão presentes no PRP. Também tem sido aplicada em doenças da superfície ocular com benefícios clínicos no alívio dos^sintomas11.

A ligação cruzada entre defeitos epiteliais e inflamação é complexa. Notadamente, a imunofisiopatologia é outra questão importante nas doenças da superfície ocular. Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β e IFN-γ, sejam mediadores fundamentais em cascatas inflamatórias¹². Novos caminhos de tratamento são assim abertos a partir da compreensão do mecanismo imunológico. Estratégias para interromper esse processo inflamatório, incluindo a produção de antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) e outras citocinas anti-inflamatórias, também podem desempenhar um papel importante nas doenças da superfície ocular13,14,15.

Desde 1998, a ortocina, soro condicionado autólogo (SCA) comercializado, tem sido utilizada clinicamente em pacientes ortopédicos portadores de osteoartrite (OA), artrite reumatoide (AR) e distúrbios da coluna vertebral¹³. Em comparação com EA e PRP, o tratamento com esferas de vidro revestidas quimicamente e incubação hipóxica para ativar monócitos são as características específicas da SCA¹⁶. Teoricamente, mais fatores anti-inflamatórios podem ser secretados pela adição de estresse de sobrevivência às células, resultando em uma maior concentração de componentes imunomoduladores essenciais, incluindo IL-1Ra. Os melhores benefícios terapêuticos da SCA na OA, em comparação com a EA, também foram relatados¹⁷. As doenças da superfície ocular compartilham antecedentes imunológicos semelhantes com as doenças inflamatórias ortopédicas em alguns aspectos. Portanto, com base nos resultados bem-sucedidos da terapia derivada do sangue humano no campo ortopédico, a SCA pode ter vantagens sobre os tratamentos convencionais na prática clínica pelas propriedades epiteliotrópicas e imunomoduladoras. Embora a SCA tenha sido amplamente utilizada em doenças inflamatórias ortopédicas, suas aplicações clínicas em oftalmologia ainda precisam ser exploradas, o que pode ser dificultado pelo seu alto custo, falta de respaldo na literatura e falta de padronização do processo de preparo, resultando em desempenho diversificado.

Neste artigo em vídeo, um método novo, econômico e conveniente foi demonstrado para gerar a SCA modificada (mACS), ou plasma rico em fatores de crescimento (PRGF), produzindo uma solução de colírio com um valor prático comparável às SCAs comercializadas. As idéias-chave de adicionar anticoagulantes e desencadear as células sanguíneas para secretar citocinas anti-inflamatórias por incubação estressada foram mantidas, mas ao contrário dos métodos quimicamente induzidos, como aqueles baseados em esferas de vidro revestidas com CrSO₄ e kits comerciais, o estado crítico de estresse é fisicamente induzido pela incubação hipóxica neste método. Além disso, o glicerol foi adicionado para proporcionar benefícios extras, incluindo aumento da estabilidade da membrana das células sanguíneas, manutenção de uma pressão adequada do líquido extracelular osmótico¹⁸ e uma fonte adequada de nutrientes em condições hipóxicas que evitam o estresse excessivo das células.

Protocolo

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais no início da seção de protocolo. Todos os protocolos e procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Fundação Médica Chang Gung. Todos os voluntários foram informados sobre a natureza deste estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes de sua inclusão. Os consumíveis necessários para todo o procedimento experimental são apresentados na Figura 1 e Figura 2, bem como na Tabela de Materiais.

1. Preparação dos materiais necessários para produzir colírios mACS

1. Preparar 250 mL de solução de glicerol a 10% e manter pronto um conjunto de infusão de asas de borboleta de 21 G, uma seringa de 3 mL sem agulha e seis tubos vacutainer de 10 mL contendo heparina 158 unidades USP (Figura 1).
2. Conecte a agulha de coleta de sangue 21 G à seringa de 3 mL e retire 3 mL de solução de glicerol a 10% na seringa preparada.
   NOTA: Todos os materiais devem ser esterilizados antes da inserção da agulha.
3. Distribuir a solução de glicerol a 10% nos tubos vacutainer em sequência, com aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada um (Figura 3A).
   NOTA: Devido à pressão negativa no tubo de ensaio, a agulha deve sair imediatamente após entrar para distribuir uniformemente 3 mL de solução de glicerol para os seis tubos de ensaio.
4. Esterilizar a pele do paciente com cotonetes estéreis com álcool 75%. Puncionar a veia superficial dos membros superiores do paciente com a agulha de coleta de sangue 18G. Extrair 60-70 mL de sangue venoso da veia superficial no total.

2. Preparação para colírios mACS

1. Injetar sequencialmente 10 mL do sangue venoso coletado em cada um dos seis tubos vacutainer (Figura 3B).
   NOTA: Esta etapa depende da pressão negativa do vácuo para encher os tubos. Para evitar a ruptura das células sanguíneas e hemólise, não aplique pressão positiva.
2. Colocar os seis tubos vacutainer na incubadora com uma temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C).
   NOTA: O estado hipóxico é mantido e estabilizado pela pressão negativa remanescente em um tubo selado que recebeu glicerol.
3. Retire os tubos da incubadora após 4 h e centrifugue-os a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente.
4. Nesse momento, prepare os materiais para extração do mACS, incluindo os frascos de colírio esterilizados, uma seringa de 3 mL com a agulha, um filtro de 0,22 μm, uma agulha de 18 G e um par de luvas estéreis (Figura 2).
   NOTA: A mesa cirúrgica deve ser limpa com álcool a 75% para garantir um ambiente asséptico. O sobrenadante, após centrifugação, já é um produto semiacabado do mACS.
5. Coloque os seis tubos no rack de tubos e abra as tampas após a centrifugação completa (Figura 3D).
   NOTA: A esterilidade não é necessária nesta etapa.
6. Coloque luvas estéreis e retire o mACS um a um usando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 18 G.
   NOTA: Tenha cuidado para não retirar a camada inferior de células sanguíneas durante esta etapa (Figura 3E).
7. Puxe a agulha, conecte-a ao filtro de 0,22 μm e conecte a agulha de coleta de sangue de 23 G, 1,5 com a seringa original de 3 mL à saída abaixo (Figura 3F).
8. Empurre a agulha suavemente através do filtro de 0,22 μm para os frascos de colírio estéril preparados (Figura 3G).
9. Repita as etapas acima até que todos os mACS tenham sido filtrados e armazenados em frascos de colírio (Figura 3H).
10. Conservar o colírio mACS a 4 °C para utilização imediata; conservar a -20 °C para preservação a longo prazo.
    NOTA: Não os mantenha durante mais de 2 semanas a 4 °C ou durante mais de 3 meses a -20 °C ^9,19.

3. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano murino

NOTA: O modelo animal ex vivo a seguir foi baseado na experiência prévia de Hung e col. sobre lesões mecânicas do epitélio corneano²⁰. Os passos seguintes devem ser realizados sob o microscópio para criar uma ferida epitelial corneana bem circunscrita e consistente.

1. Anestesiar os camundongos C57BL/6 com isoflurano a 3%-4%. Recuar o punção da biópsia de pele sobre a córnea central murina, deixando um círculo raso no epitélio como uma margem uniforme da ferida.
   NOTA: Seja gentil para evitar a ruptura do globo ocular.
2. Desbridar o epitélio corneano dentro da área confirmada até a camada de Bowman, com um removedor de anel de ferrugem corneana equipado com uma broca de 0,5 mm.
3. Para estabelecer o modelo animal ex vivo da ferida corneana mecânica, colher o globo ocular e preparar bem a cultura.
   1. Eutanasiar os ratos primeiro; Em seguida, pressione suavemente as bordas orbitárias superior e inferior dos camundongos, introduza a ponta da pinça sobre o espaço retrobulbar, saia do globo ocular e segure-o pela pinça.
   2. Cortar o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar perfeitamente o globo ocular.
   3. Prepare um prato de 96 poços com cera derretida em seu interior. Crie rapidamente um orifício redondo usando as pontas das pinças e aguarde a solidificação.
4. Preparar os meios a serem testados: 0,5% mACS, 0,5% AS para comparação, soro fisiológico normal como controle negativo e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
   NOTA: mACS é obtido usando o protocolo mencionado acima.
5. Para a cultura ex vivo , coloque o globo ocular colhido na placa preparada de 96 poços. Adicionar 200 μL de cada meio na placa de 96 poços.
6. Coloque a placa de cultura de 96 poços na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. Garantir que os meios de cultura sejam trocados a cada 24 h.
7. Para confirmar o efeito sequencial da cicatrização da ferida, monitorar a área da ferida epitelial sob o microscópio a cada 8 h por coloração de fluoresceína.
   1. Dissolva a fluoresceína no papel fluoresceína com soro fisiológico.
   2. Solte o corante fluoresceína na córnea central murina, depois observe e documente-o sob um microscópio. Um resultado típico é mostrado na Figura 4.
      NOTA: Uma gota (aproximadamente 0,05 mL) de corante fluoresceína é suficiente para a observação.

Resultados

A Figura 1 e a Figura 2 mostram os materiais necessários para o experimento, e a Figura 3 mostra as etapas sequenciais e os produtos intermediários bem-sucedidos durante a preparação do mACS. Primeiro, 0,5 mL de solução de glicerol a 10% foi adicionado a cada tubo de ensaio estéril de 10 mL (Figura 3A). Em seguida, 60-70 mL de sangue venoso foram obtidos do paciente, e 10 mL de sangue foram injet...

Discussão

Neste estudo, um protocolo para a preparação de mACS é descrito e o benefício do colírio mACS na cicatrização de feridas de modelos animais é ainda mostrado. A modificação crucial deste protocolo mACS é a adição de aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada tubo de ensaio, o que cria condições hipóxicas adequadas durante as 4 h de incubação a 37 °C. Esta configuração fornece o AS com estresse adequado e células prontas para secretar os fatores de crescimento necessários que ajud...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004