Production de sérum conditionné autologue modifié et évaluation ex vivo de son potentiel de guérison dans l’épithélium cornéen murin

Résumé

Cet article décrit un protocole visant à simplifier le processus et à rendre la préparation du sérum conditionné autologue (ACS) moins coûteuse. Aucune seringues spéciales ou perles de verre revêtues en surface n’est nécessaire. De plus, l’ACS modifié (mACS) présente des avantages concurrentiels par rapport au sérum autologue conventionnel dans la cicatrisation des plaies cornéennes des yeux murins ex vivo.

Résumé

Les thérapies topiques dérivées du sang humain ont été une aubaine pour les cliniciens au cours des dernières décennies. Le sérum autologue (SA) et le plasma riche en plaquettes (PRP) sont enrichis en facteurs de croissance épithéliotropes essentiels à la cicatrisation des plaies cornéennes. Contrairement à la SA, le PRP est basé sur un système de centrifugation différentielle, produisant davantage de facteurs de croissance dérivés des plaquettes. Le sérum conditionné autologue (ACS) préserve non seulement la préparation de la SA et du PRP, mais se concentre également sur les propriétés immunomodulatrices, qui sont importantes dans les maladies inflammatoires.

L’absence de protocoles normalisés et les coûts de préparation élevés sont des limites pour l’application clinique du SCA. Cette expérience vidéo démontre une procédure opératoire standard pour la préparation de gouttes ophtalmiques à sérum conditionné autologue modifié (mACS). Tout d’abord, le glycérol a été ajouté dans les seringues d’héparine comme stabilisateur des cellules sanguines pendant l’incubation hypoxique. Pour activer les cellules sanguines, une incubation de 4 h à 37 °C a été initiée. Ensuite, les échantillons de sang ont été centrifugés à 3 500 × g pendant 10 min à température ambiante. Après filtration du surnageant à travers un filtre de 0,22 μm, les gouttes ophtalmiques mACS ont été entièrement préparées.

Un essai provisoire de l’effet thérapeutique du mACS a montré qu’il pourrait avoir des avantages concurrentiels par rapport à la SA conventionnelle dans la cicatrisation des plaies cornéennes dans les yeux de souris ex vivo . La SA utilisée dans cette étude a été préparée en fonction des études publiées et de la pratique clinique dans notre hôpital. Par conséquent, l’efficacité du mACS sur les maladies de la surface oculaire pourrait être évaluée dans de futures recherches par le biais d’études in vivo sur des animaux et d’essais cliniques.

Introduction

Les effets thérapeutiques du sérum autologue (SA) dans les maladies de la sécheresse oculaire ont été signalés pour la première fois dans les années 1980 par Fox et ^coll.1. On pense que la propriété lubrifiante et les composants biochimiques épithéliotropes essentiels de la SA, imitant les larmes naturelles, favorisent la prolifération des cellules épithéliales cornéennes. Au cours des dernières décennies, plusieurs études ont été réalisées sur cette base. Les composants trophiques comprennent le facteur de croissance épidermique (EGF), la vitamine A, le facteur de croissance transformant β (TGF-β) et d’autres cytokines. Fait intéressant, le sérum est riche en TGF-β et en vitamine A, qui joueraient un rôle central dans la prolifération épidermique 2,3,4,5. En outre, lors du traitement de patients atteints de maladies de la surface oculaire, plusieurs études ont montré certains avantages des gouttes ophtalmiques SA dans les résultats rapportés par les patients, d’autres paramètres objectifs de sécheresse oculaire ^6,7 et des résultats microscopiques tels que la densité cellulaire⁸. Les études de méta-analyse ont révélé qu’il pourrait y avoir certains avantages à améliorer les syndromes des patients avec le traitement par gouttes ophtalmiques SA, mais les résultats et les observations à long terme font encore défaut ^9,10.

Contrairement à la SA, le plasma riche en plaquettes (PRP) est dérivé de l’ajout d’un anticoagulant pendant la préparation, avec une centrifugation différentielle supplémentaire et une activation chimique des plaquettes. Par rapport à la SA, de nombreux produits chimiques et facteurs de croissance, tels que le TGF-β, le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et l’EGF, sont présents dans le PRP. Il a également été appliqué aux maladies de la surface oculaire avec des avantages cliniques dans le soulagement des symptômes¹¹.

La réticulation entre les défauts épithéliaux et l’inflammation est complexe. Notamment, l’immunophysiopathologie est un autre problème important dans les maladies de la surface oculaire. Les cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β et l’IFN-γ, seraient des médiateurs essentiels dans les cascades inflammatoires¹². De nouvelles pistes de traitement s’ouvrent ainsi à partir de la compréhension du mécanisme immunitaire. Les stratégies visant à arrêter ce processus inflammatoire, y compris la production d’antagoniste des récepteurs de l’interleukine-1 (IL-1Ra) et d’autres cytokines anti-inflammatoires, peuvent également jouer un rôle important dans les maladies de la surface oculaire^13,14,15.

Depuis 1998, Orthokine, un sérum conditionné autologue commercialisé (SCA), est utilisé cliniquement chez les patients orthopédiques souffrant d’arthrose, de polyarthrite rhumatoïde (PR) et de troubles de la colonne vertébrale¹³. Par rapport à l’AS et au PRP, le traitement avec des billes de verre enduites chimiquement et l’incubation hypoxique pour activer les monocytes sont les caractéristiques spécifiques de l’ACS¹⁶. Théoriquement, plus de facteurs anti-inflammatoires peuvent être sécrétés en ajoutant un stress de survie aux cellules, ce qui entraîne une concentration plus élevée de composants immunomodulateurs essentiels, y compris l’IL-1Ra. L’amélioration des bénéfices thérapeutiques du SCA dans l’arthrose, par rapport à la SA, a également été rapportée¹⁷. Les maladies de la surface oculaire partagent des antécédents immunitaires similaires à ceux des maladies inflammatoires orthopédiques à certains égards. Par conséquent, sur la base des résultats positifs de la thérapie dérivée du sang humain dans le domaine orthopédique, ACS pourrait présenter des avantages par rapport aux traitements conventionnels en pratique clinique par des propriétés épithéliotropes et immunomodulatrices. Bien que le SCA ait été largement utilisé dans les maladies inflammatoires orthopédiques, ses applications cliniques en ophtalmologie doivent encore être explorées, ce qui peut être entravé par son coût élevé, le manque de support documentaire et le manque de normalisation du processus de préparation, ce qui entraîne des performances diverses.

Dans cet article vidéo, une méthode novatrice, rentable et pratique a été démontrée pour générer l’ACS modifié (mACS), ou plasma riche en facteurs de croissance (PRGF), produisant une solution de gouttes oculaires avec une valeur pratique comparable aux ACS commercialisés. Les idées clés de l’ajout d’anticoagulants et du déclenchement de la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires par incubation stressée par les cellules sanguines ont été retenues, mais contrairement aux méthodes induites chimiquement, telles que celles basées sur des perles de verre enduites de CrSO₄ et des kits commerciaux, le statut de stress critique est physiquement induit par l’incubation hypoxique dans cette méthode. De plus, le glycérol a été ajouté pour fournir des avantages supplémentaires, y compris une augmentation de la stabilité de la membrane des cellules sanguines, le maintien d’une pression de fluide extracellulaire osmotique^{appropriée 18} et une source appropriée de nutriments dans des conditions hypoxiques qui évitent de surcharger les cellules.

Protocole

La recherche a été effectuée conformément aux lignes directrices institutionnelles au début de la section du protocole. Tous les protocoles et procédures ont été mis en œuvre conformément à la Déclaration d’Helsinki et ont été examinés et approuvés par le Comité d’examen institutionnel de la Fondation médicale Chang Gung. Tous les volontaires ont été informés de la nature de cette étude et ont signé un formulaire de consentement éclairé avant leur inclusion. Les consommables nécessaires à l’ensemble de la procédure expérimentale sont présentés à la figure 1 et à la figure 2, ainsi que dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des matériaux nécessaires à la production de gouttes ophtalmiques mACS

1. Préparer 250 mL de solution de glycérol à 10 % et conserver un ensemble de perfusion à ailes papillon de 21 g, une seringue de 3 mL sans aiguille et six tubes vacutainer de 10 ml contenant de l’héparine 158 unités USP (Figure 1).
2. Connectez l’aiguille de prélèvement sanguin de 21 G à la seringue de 3 mL et retirez 3 mL de solution de glycérol à 10 % dans la seringue préparée.
   REMARQUE : Tous les matériaux doivent être stérilisés avant l’insertion de l’aiguille.
3. Répartir la solution de glycérol à 10 % dans les tubes vacutainer en séquence, avec environ 0,5 mL de solution de glycérol à 10 % dans chacun (Figure 3A).
   REMARQUE: En raison de la pression négative dans le tube à essai, l’aiguille doit sortir immédiatement après son entrée pour répartir uniformément 3 mL de solution de glycérol dans les six tubes à essai.
4. Stérilisez la peau du patient avec des cotons-tiges stériles à 75% d’alcool. Percez la veine superficielle des membres supérieurs du patient avec l’aiguille de prélèvement sanguin de 18 G. Prélever 60 à 70 mL de sang veineux de la veine superficielle au total.

2. Préparation pour les gouttes ophtalmiques mACS

1. Injecter séquentiellement 10 mL du sang veineux prélevé dans chacun des six tubes vacutainer (figure 3B).
   REMARQUE: Cette étape repose sur la pression négative du vide pour remplir les tubes. Pour éviter la perturbation des cellules sanguines et l’hémolyse, n’appliquez aucune pression positive.
2. Placer les six tubes vacutainer dans l’incubateur à température constante de 37 °C pendant 4 h (figure 3C).
   REMARQUE: L’état hypoxique est maintenu et stabilisé par la pression négative restante dans un tube scellé qui a reçu du glycérol.
3. Sortez les tubes de l’incubateur après 4 h et centrifugez-les à 3 500 × g pendant 10 min à température ambiante.
4. À ce stade, préparez le matériel pour l’extraction du mACS, y compris les flacons de gouttes ophtalmiques stérilisés, une seringue de 3 ml avec l’aiguille, un filtre de 0,22 μm, une aiguille de 18 g et une paire de gants stériles (figure 2).
   REMARQUE: La table d’opération doit être essuyée avec de l’alcool à 75% pour assurer un environnement aseptique. Le surnageant, après centrifugation, est déjà un produit semi-fini de mACS.
5. Placez les six tubes sur la grille à tubes et ouvrez les bouchons après une centrifugation complète (Figure 3D).
   REMARQUE: La stérilité n’est pas requise dans cette étape.
6. Mettez des gants stériles et retirez le mACS un par un à l’aide d’une seringue de 3 ml avec une aiguille de 18 g.
   REMARQUE : Veillez à ne pas prélever la couche inférieure de cellules sanguines au cours de cette étape (Figure 3E).
7. Retirez l’aiguille, branchez-la au filtre de 0,22 μm et connectez l’aiguille de prélèvement sanguin de 23 G, 1,5 po avec la seringue originale de 3 mL à la sortie ci-dessous (Figure 3F).
8. Poussez doucement l’aiguille à travers le filtre de 0,22 μm dans les flacons de gouttes ophtalmiques stériles préparés (Figure 3G).
9. Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que tous les mACS aient été filtrés et stockés dans des flacons de gouttes ophtalmiques (Figure 3H).
10. Conservez les gouttes ophtalmiques mACS à 4 °C pour une utilisation immédiate; conserver à -20 °C pour une conservation à long terme.
    NOTE: Ne pas les conserver plus de 2 semaines à 4 °C ou plus de 3 mois à -20 °C ^9,19.

3. Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen murin

NOTE: Le modèle animal ex vivo suivant était basé sur l’expérience antérieure de Hung et al. sur les lésions mécaniques de l’épithélium cornéen²⁰. Les étapes suivantes doivent être effectuées au microscope pour créer une plaie épithéliale cornéenne bien circonscrite et cohérente.

1. Anesthésier les souris C57BL/6 avec 3 % à 4 % d’isoflurane. Indenter le poinçon de biopsie cutanée sur la cornée centrale murine, en laissant un cercle peu profond sur l’épithélium comme une marge uniforme de la plaie.
   REMARQUE: Soyez doux pour éviter la rupture du globe oculaire.
2. Débrider l’épithélium cornéen dans la zone confirmée jusqu’à la couche de Bowman, avec un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne équipé d’une bavure de 0,5 mm.
3. Pour établir le modèle animal ex vivo de la plaie cornéenne mécanique, récoltez le globe oculaire et préparez bien la culture.
   1. Euthanasier les souris en premier; Ensuite, appuyez doucement sur les bords orbitaux supérieurs et inférieurs des souris, introduisez la pointe de la pince sur l’espace rétrobulbaire, puis sortez le globe oculaire et tenez-le par la pince.
   2. Coupez le nerf optique et les tissus mous périorbitaires avec des ciseaux cornéens pour isoler parfaitement le globe oculaire.
   3. Préparez une assiette de 96 puits avec de la cire fondue à l’intérieur. Créez rapidement un trou rond à l’aide des pointes des pinces, puis attendez la solidification.
4. Préparer les milieux à tester : 0,5 % mACS, 0,5 % AS à titre de comparaison, solution saline normale comme témoin négatif et milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
   REMARQUE: mACS est obtenu en utilisant le protocole mentionné ci-dessus.
5. Pour la culture ex vivo , placer le globe oculaire récolté sur la plaque préparée à 96 puits. Ajouter 200 μL de chaque milieu dans la plaque de 96 puits.
6. Placer la plaque de culture de 96 puits dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂. Assurez-vous que les milieux de culture sont changés toutes les 24 heures.
7. Pour confirmer l’effet séquentiel de cicatrisation, surveiller la zone de la plaie épithéliale au microscope toutes les 8 heures par coloration à la fluorescéine.
   1. Dissoudre la fluorescéine sur le papier fluorescéine avec une solution saline normale.
   2. Déposez le colorant fluorescéine sur la cornée centrale murine, puis observez-le et documentez-le au microscope. Un résultat typique est illustré à la figure 4.
      REMARQUE : Une goutte (environ 0,05 mL) de colorant fluorescéine suffit pour l’observation.

Résultats

Les figures 1 et 2 montrent les matériaux nécessaires à l’expérience, et la figure 3 montre les étapes séquentielles et les produits intermédiaires réussis lors de la préparation du mACS. Tout d’abord, 0,5 mL de solution de glycérol à 10 % a été ajouté dans chaque tube à essai stérile de 10 mL (figure 3A). Ensuite, 60 à 70 mL de sang veineux ont été obtenus du patient, et 10 mL de...

Discussion

Dans cette étude, un protocole pour la préparation du mACS est décrit et le bénéfice des gouttes ophtalmiques mACS dans la cicatrisation des plaies de modèles animaux est également démontré. La modification cruciale de ce protocole mACS est l’ajout d’environ 0,5 mL de solution de glycérol à 10% dans chaque tube à essai, ce qui crée des conditions hypoxiques appropriées pendant l’incubation de 4 heures à 37 °C. Ce réglage fournit à l’AS un stress approprié et incite les cellules à sécréter l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004