Producción de suero condicionado autólogo modificado y evaluación ex vivo de su potencial curativo en el epitelio corneal murino

Resumen

Este artículo describe un protocolo para simplificar el proceso y hacer que la preparación de suero condicionado autólogo (SCA) sea menos costosa. No se necesitan jeringas especiales ni perlas de vidrio recubiertas superficialmente. Además, el SCA modificado (mACS) tiene ventajas competitivas sobre el suero autólogo convencional en la cicatrización de heridas corneales de ojos murinos ex vivo.

Resumen

Las terapias tópicas derivadas de la sangre humana han sido una bendición para los médicos en las últimas décadas. El suero autólogo (EA) y el plasma rico en plaquetas (PRP) están enriquecidos en factores de crecimiento epiteliotrópicos que son esenciales en la cicatrización de heridas corneales. A diferencia de AS, PRP se basa en un sistema de centrifugación diferencial, produciendo más factores de crecimiento derivados de plaquetas. El suero autólogo condicionado (SCA) no solo preserva la preparación de AS y PRP, sino que también se centra en las propiedades inmunomoduladoras, que son importantes en las enfermedades inflamatorias.

La falta de protocolos estandarizados y los altos costos de preparación son limitaciones para la aplicación clínica de SCA. Este experimento en video demuestra un procedimiento operativo estándar para preparar gotas oftálmicas modificadas de suero autólogo condicionado (mACS). Primero, se agregó glicerol en jeringas de heparina como estabilizador de células sanguíneas durante la incubación hipóxica. Para activar las células sanguíneas, se inició una incubación de 4 h a 37 °C. Luego, las muestras de sangre se centrifugaron a 3.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm, las gotas oftálmicas mACS se prepararon completamente.

Una prueba tentativa del efecto terapéutico de mACS mostró que puede tener ventajas competitivas sobre la EA convencional en la cicatrización de heridas corneales en ojos de ratón ex vivo . La EA utilizada en este estudio fue preparada de acuerdo con los estudios publicados y la práctica clínica en nuestro hospital. Por lo tanto, la eficacia de mACS en enfermedades de la superficie ocular podría evaluarse en futuras investigaciones a través de estudios in vivo en animales y ensayos clínicos.

Introducción

Los efectos terapéuticos del suero autólogo (EA) en las enfermedades del ojo seco fueron reportados por primera vez en la década de 1980 por Fox et ^al.1. Se cree que tanto la propiedad lubricante como los componentes bioquímicos epiteliotrópicos esenciales en la EA, imitando las lágrimas naturales, benefician la proliferación de células epiteliales corneales. En las últimas décadas, se han realizado varios estudios sobre esta base. Los componentes tróficos incluyen factor de crecimiento epidérmico (EGF), vitamina A, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y otras citocinas. Curiosamente, el suero es rico en TGF-β y vitamina A, que se cree que desempeñan un papel fundamental en la proliferación epidérmica 2,3,4,5. Además, al tratar a pacientes con enfermedades de la superficie ocular, varios estudios han demostrado algunas ventajas de las gotas oftálmicas AS en los resultados informados por los pacientes, otros parámetros objetivos del ojo seco ^6,7 y hallazgos microscópicos como la densidad celular⁸. Los estudios de metanálisis revelaron que podría haber algunos beneficios en la mejora de los síndromes del paciente con el tratamiento con gotas oftálmicas para la EA, pero aún faltan resultados y observaciones a largo plazo ^9,10.

A diferencia de la EA, el plasma rico en plaquetas (PRP) se deriva de la adición de un anticoagulante durante la preparación, con una centrifugación diferencial adicional y la activación química de las plaquetas. En comparación con la EA, numerosos productos químicos y factores de crecimiento, como TGF-β, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y EGF, están presentes en PRP. También se ha aplicado a las enfermedades de la superficie ocular con beneficios clínicos en el alivio de los síntomas¹¹.

El vínculo cruzado entre los defectos epiteliales y la inflamación es complejo. En particular, la inmunofisiopatología es otro tema importante en las enfermedades de la superficie ocular. Se cree que las citoquinas proinflamatorias, como IL-1β e IFN-γ, son mediadores fundamentales en cascadas inflamatorias¹². Se abren así nuevas vías de tratamiento basadas en la comprensión del mecanismo inmune. Las estrategias para detener este proceso inflamatorio, incluyendo la producción de antagonistas del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) y otras citoquinas antiinflamatorias, también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades de la superficie ocular^13,14,15.

Desde 1998, Orthokine, un suero condicionado autólogo (SCA) comercializado, ha sido utilizado clínicamente en pacientes ortopédicos que sufren de osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR) y trastornos de la columna vertebral¹³. En comparación con AS y PRP, el tratamiento con perlas de vidrio recubiertas químicamente y la incubación hipóxica para activar monocitos son las características específicas de ACS¹⁶. Teóricamente, se pueden secretar más factores antiinflamatorios al agregar estrés de supervivencia a las células, lo que resulta en una mayor concentración de componentes inmunomoduladores esenciales, incluida la IL-1Ra. Los beneficios terapéuticos mejorados del SCA en la OA, en comparación con la EA, también han sido reportados¹⁷. Las enfermedades de la superficie ocular comparten antecedentes inmunes similares con las enfermedades inflamatorias ortopédicas en algunos aspectos. Por lo tanto, sobre la base de los resultados exitosos de la terapia derivada de la sangre humana en el campo ortopédico, el SCA podría tener ventajas sobre los tratamientos convencionales en la práctica clínica por sus propiedades epiteliotrópicas e inmunomoduladoras. Aunque el SCA ha sido ampliamente utilizado en enfermedades inflamatorias ortopédicas, sus aplicaciones clínicas en oftalmología aún necesitan ser exploradas, lo que puede verse obstaculizado por su alto costo, falta de apoyo de la literatura y falta de estandarización del proceso de preparación, lo que resulta en un rendimiento diverso.

En este artículo de video, se demostró un método novedoso, rentable y conveniente para generar el ACS modificado (mACS), o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), produciendo una solución de gotas para los ojos con un valor práctico comparable al ACS comercializado. Se mantuvieron las ideas clave de agregar anticoagulantes y activar las células sanguíneas para secretar citoquinas antiinflamatorias mediante incubación estresada, pero a diferencia de los métodos inducidos químicamente, como los basados en perlas de vidrio recubiertas de CrSO₄ y kits comerciales, el estado de estrés crítico es inducido físicamente por la incubación hipóxica en este método. Además, se agregó glicerol para proporcionar beneficios adicionales, incluido un aumento en la estabilidad de la membrana de las células sanguíneas, el mantenimiento de una presión adecuada del líquido extracelular osmótico¹⁸ y una fuente adecuada de nutrientes en condiciones hipóxicas que evitan el estrés excesivo de las células.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales al inicio de la sección de protocolo. Todos los protocolos y procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Fundación Médica Chang Gung. Todos los voluntarios fueron informados de la naturaleza de este estudio y firmaron un formulario de consentimiento informado antes de su inclusión. Los consumibles necesarios para todo el procedimiento experimental se presentan en la Figura 1 y la Figura 2, así como en la Tabla de materiales.

1. Preparación de los materiales necesarios para producir gotas oftálmicas mACS

1. Prepare 250 ml de solución de glicerol al 10% y mantenga listo un equipo de infusión de alas de mariposa de 21 G, una jeringa de 3 ml sin la aguja y seis tubos de vacutainer de 10 ml que contengan heparina 158 unidades USP listas (Figura 1).
2. Conecte la aguja de recolección de sangre de 21 G a la jeringa de 3 ml y extraiga 3 ml de solución de glicerol al 10% en la jeringa preparada.
   NOTA: Todos los materiales deben esterilizarse antes de insertar la aguja.
3. Distribuir la solución de glicerol al 10% en los tubos de vacutainer en secuencia, con aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada uno (Figura 3A).
   NOTA: Debido a la presión negativa en el tubo de ensayo, la aguja debe salir inmediatamente después de entrar para distribuir uniformemente 3 ml de solución de glicerol a los seis tubos de ensayo.
4. Esterilice la piel del paciente con hisopos de algodón estériles con alcohol al 75%. Perforar la vena superficial de las extremidades superiores del paciente con la aguja de recolección de sangre de 18 G. Extraiga 60-70 ml de sangre venosa de la vena superficial en total.

2. Preparación para las gotas oftálmicas mACS

1. Inyectar secuencialmente 10 ml de la sangre venosa extraída en cada uno de los seis tubos vacutainer (Figura 3B).
   NOTA: Este paso se basa en la presión negativa del vacío para llenar los tubos. Para evitar la alteración de las células sanguíneas y la hemólisis, no aplique ninguna presión positiva.
2. Colocar los seis tubos vacutainer en la incubadora con una temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C).
   NOTA: El estado hipóxico se mantiene y estabiliza por la presión negativa restante en un tubo sellado que recibió glicerol.
3. Retirar los tubos de la incubadora después de 4 h y centrifugarlos a 3.500 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
4. En este punto, prepare los materiales para la extracción de mACS, incluidos los frascos de gotas oculares esterilizados, una jeringa de 3 ml con la aguja, un filtro de 0,22 μm, una aguja de 18 G y un par de guantes estériles (Figura 2).
   NOTA: La mesa de operaciones debe limpiarse con alcohol al 75% para garantizar un ambiente aséptico. El sobrenadante, después de la centrifugación, ya es un producto semiacabado de mACS.
5. Coloque los seis tubos en el bastidor de tubos y abra las tapas después de completar la centrifugación (Figura 3D).
   NOTA: No se requiere esterilidad en este paso.
6. Póngase guantes estériles y extraiga el mACS uno por uno usando una jeringa de 3 ml con una aguja de 18 G.
   NOTA: Tenga cuidado de no extraer la capa inferior de células sanguíneas durante este paso (Figura 3E).
7. Extraiga la aguja, conéctela al filtro de 0,22 μm y conecte la aguja de recolección de sangre de 23 G, 1,5 pulgadas con la jeringa original de 3 ml a la salida a continuación (Figura 3F).
8. Empuje suavemente la aguja a través del filtro de 0,22 μm en los frascos estériles preparados para gotas para los ojos (Figura 3G).
9. Repita los pasos anteriores hasta que todos los mACS se hayan filtrado y almacenado en frascos de gotas para los ojos (Figura 3H).
10. Conservar las colirios mACS a 4 °C para su uso inmediato; conservar a -20 °C para su conservación a largo plazo.
    NOTA: No los conserve durante más de 2 semanas a 4 °C o durante más de 3 meses a -20 °C ^9,19.

3. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal murino

NOTA: El siguiente modelo animal ex vivo se basó en la experiencia previa de Hung et al. sobre lesiones mecánicas del epitelio corneal²⁰. Los siguientes pasos deben realizarse bajo el microscopio para crear una herida epitelial corneal bien circunscrita y consistente.

1. Anestesiar a los ratones C57BL/6 con 3% -4% de isoflurano. Aplique el punzón de biopsia de piel sobre la córnea central murina, dejando un círculo poco profundo en el epitelio como un margen uniforme de la herida.
   NOTA: Sea suave para evitar la ruptura del globo ocular.
2. Debridar el epitelio corneal dentro del área confirmada hasta la capa de Bowman, con un removedor de anillo de óxido corneal equipado con una rebaba de 0,5 mm.
3. Para establecer el modelo animal ex vivo de la herida corneal mecánica, cosechar el globo ocular y preparar bien el cultivo.
   1. Eutanasia a los ratones primero; Luego, presione suavemente los bordes orbitales superior e inferior de los ratones, introduzca la punta de los fórceps sobre el espacio retrobulbar y saque el globo ocular y sosténgalo por los fórceps.
   2. Cortar el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar perfectamente el globo ocular.
   3. Prepare un plato de 96 pocillos con cera derretida en su interior. Cree rápidamente un orificio redondo usando las puntas de las pinzas y luego espere la solidificación.
4. Prepare los medios a probar: 0.5% mACS, 0.5% AS para comparación, solución salina normal como control negativo y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
   NOTA: mACS se obtiene utilizando el protocolo mencionado anteriormente.
5. Para el cultivo ex vivo , coloque el globo ocular cosechado en la placa preparada de 96 pocillos. Agregue 200 μL de cada medio en la placa de 96 pocillos.
6. Colocar la placa de cultivo de 96 pocillos en la incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2. Asegúrese de que los medios de cultivo se cambien cada 24 h.
7. Para confirmar el efecto secuencial de cicatrización de heridas, controle el área de la herida epitelial bajo el microscopio cada 8 h mediante tinción con fluoresceína.
   1. Disuelva la fluoresceína en el papel fluoresceína con solución salina normal.
   2. Deje caer el tinte fluoresceína sobre la córnea central murina, luego obsérvelo y documéntelo bajo un microscopio. Un resultado típico se muestra en la Figura 4.
      NOTA: Una gota (aproximadamente 0,05 ml) de colorante fluoresceína es suficiente para la observación.

Resultados

La Figura 1 y la Figura 2 muestran los materiales necesarios para el experimento, y la Figura 3 muestra los pasos secuenciales y los productos intermedios exitosos durante la preparación de mACS. Primero, se agregaron 0.5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo estéril de 10 ml (Figura 3A). Luego, se obtuvieron 60-70 mL de sangre venosa del paciente, y se inyectaron 10 mL de sangre e...

Discusión

En este estudio, se describe un protocolo para la preparación de mACS y se muestra además el beneficio de las gotas oftálmicas mACS en la cicatrización de heridas de modelos animales. La modificación crucial de este protocolo mACS es la adición de aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo, lo que crea condiciones hipóxicas adecuadas durante la incubación de 4 h a 37 °C. Esta configuración proporciona al AS el estrés adecuado y hace que las células secreten los factores de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004