冷冻保存的上皮隐窝仔猪肠道3D类器官的培养和细胞单层的建立

摘要

在这里，我们描述了从冷冻保存的上皮隐窝培养猪肠道3D类器官的方案。我们还描述了一种建立源自3D类器官的细胞单层的方法，允许进入上皮细胞的顶端。

摘要

肠道类器官越来越多地用于研究肠道上皮以进行消化系统疾病建模，或研究与药物、营养素、代谢物、病原体和微生物群的相互作用。培养肠道类器官的方法现在可用于多种物种，包括猪，猪是作为农场动物和人类翻译模型的主要兴趣物种，例如，研究人畜共患疾病。在这里，我们深入描述了用于从冷冻上皮隐窝培养猪肠道3D类器官的程序。该协议描述了如何从猪肠道冷冻保存上皮隐窝以及培养3D肠道类器官的后续程序。该方法的主要优点是（i）从3D类器官培养物中分离隐窝的时间解离，（ii）制备来自多个肠段和同时来自几只动物的大量冷冻保存的隐窝，从而（iii）减少从活体动物中取样新鲜组织的需求。我们还详细介绍了一种协议，以建立源自3D类器官的细胞单层，以允许进入上皮细胞的顶端，这是与营养物质，微生物或药物相互作用的部位。总体而言，此处描述的方案是在兽医和生物医学研究中研究猪肠上皮的有用资源。

引言

肠上皮由覆盖消化粘膜的单层细胞与管腔环境界面形成。该位置与多种功能相关，例如营养吸收和屏障功能，这些功能由干细胞和多种分化上皮细胞类型（吸收、肠内分泌、Paneth 和杯状细胞）的存在^支持1。传统上用于研究上皮细胞的永生化细胞系具有重大局限性，因为它们不能反映肠上皮的细胞复杂性并呈现基因组^异常2。Sato等人3开发的三维（3D）类^{器官为研究} 肠上皮提供了一种新的模型，具有改进的生理相关性。事实上，肠道类器官来源于未转化的干细胞，由多种细胞类型组成，并概括了肠上皮的功能。肠道类器官越来越多地用于了解肠上皮的发育和功能及其与病原体、营养素、毒素、药物、微生物群及其代谢物的相互作用²。

最初是为人类和小鼠开发的，用于培养肠道类器官的方法最近已适用于其他物种，包括猪⁴。冈萨雷斯等^人5是第一个从空肠培养猪类器官的人;从那时起，猪类器官已被描述用于其他肠道段（十二指肠、回肠和结肠）⁶，⁷，^8，并已被证明保留了位置特异性表型⁹，^10，11。猪肠道3D类器官现在通常用于研究营养素¹²，¹³或肠道感染⁶，^8，14的作用。

大多数研究都描述了从新鲜分离的上皮隐窝开始的肠道类器官培养。然而，出于后勤原因，这并不总是可行的，特别是在处理猪等大型动物时。事实上，猪的动物设施可能远离培养类器官的实验室，这使工作组织复杂化。此外，类器官培养非常耗时;因此，同时生长多个类器官系是不切实际的，例如，来自不同的肠道段或几种动物。为了规避这些问题，一些针对人类、马和猪的研究描述了从冷冻肠组织（或活检）或分离的上皮隐窝培养类器官的方法⁴，^15，16，17。这些方法允许冷冻保存来自单个动物的多个肠道段的肠上皮干细胞，然后在需要时可用于培养类器官。此外，这大大减少了用作干细胞供体的活体动物的数量，因为可以创建大量冷冻保存的隐窝（3R的原理）。该方法的另一个优点是在获得表型或基因型结果后仅从感兴趣的动物中生长肠道类器官，这是非常具有成本效益的。

在体内，肠上皮细胞极化，顶端侧指向管腔。在体外，在3D类器官中，上皮细胞的顶端侧也面向腔（即类器官内部）⁴。这种组织阻止了进入顶端侧，这在研究管腔成分（例如营养物质、微生物、代谢物）对上皮细胞的影响时是一个问题。为了规避这一缺点，已经开发了几种方法，例如将类器官细胞培养为2D单层，显微注射和极性反转（"顶端类器官"）^18，19。类器官细胞单层的培养正在成为最有效和最容易处理的系统。其原理是将3D类器官解离成单细胞，并将它们接种在先前涂有薄层细胞外基质（ECM）的细胞培养容器上²⁰。在这些培养条件下，上皮细胞的顶端面朝上，因此可以进行实验处理²⁰。类器官细胞单层的培养最近适用于猪肠^21，22;源自猪3D类器官的细胞单层已用于多种应用，包括肠道感染研究⁶，^23，24，^25，营养物质运输⁹和消化系统疾病建模²⁶。

在这里，本研究首先提出了从冷冻保存的上皮隐窝中提取的猪肠道3D类器官的培养和维持的详细方案（图1）。然后，描述了一种方案以从猪肠道3D类器官中建立细胞单层。这里描述的方法提供了实验工具，可用于研究猪肠上皮的营养转运、屏障功能和宿主-微生物相互作用。

研究方案

该协议由当地伦理委员会（N°TOXCOM/0136/PP）根据欧洲科学用途动物保护指令（2010/63/EU）批准。该协议以空肠为例进行描述，但它可用于小肠和大肠（十二指肠，空肠，回肠，结肠）的每个部分。

1.从仔猪肠中分离上皮隐窝

注意:准备完整的Dulbecco改良鹰培养基（DMEMc），其中DMEM补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素（P / S）。准备50mL等分试样，并在4°C下储存1个月。

1. 准备溶液（在隐窝隔离当天完成）
   1. 制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS），3mM二硫苏糖醇（DTT），9mM乙二胺四乙酸（EDTA），10μM Y27632 ROCK抑制剂和1%青霉素 - 链霉素（P / S）的解离溶液并储存在冰上。
   2. 制备含有DMEMc，10%FBS，10%二甲基亚砜（DMSO）和10μM Y27632 ROCK抑制剂的冷冻溶液，并储存在冰上（最终FBS浓度为18%）。
   3. 准备含有补充有1%P / S的冷PBS的运输溶液，并将其储存在冰上。
2. 分离上皮隐窝
   1. 通过电麻醉屠宰仔猪，然后放血。
   2. 屠宰后立即用手术刀打开仔猪的腹部并取出整个肠道。
   3. 收集约2厘米的肠段并将其储存在冷运输溶液中。将片段保持在冰上，直到隐窝隔离（最多2小时）。
   4. 将组织放入培养皿中。纵向打开肠段，并在补充有1%P / S的冷PBS中仔细清洗组织以去除肠道内容物。
   5. 将组织转移到装有 10 mL 补充有 1% P/S 的冷 PBS 的新培养皿中。
   6. 用镊子握住组织，并通过用显微镜载玻片刮除绒毛和剩余的粘液。
      注意:绒毛（舌形结构）的去除可以通过上清液的显微镜观察来检查。
   7. 将组织转移到含有5mL冰冷解离溶液的15mL锥形管中，并在室温（RT）下在旋转振荡器（15rpm）上孵育30分钟。
   8. 将组织转移到新的培养皿中，并加入 10 mL 补充有 1% P/S 的冷 PBS。
   9. 通过用显微镜载玻片牢固地刮擦粘膜来机械地隔离隐窝。
      注意:在显微镜下，验证PBS中是否存在上皮隐窝（图2A）。
   10. 用血清移液管吸出隐窝溶液，并通过 50 mL 锥形管中的 100 μm 细胞过滤器过滤。
   11. 移取10μL溶液，并在显微镜下验证隐窝的存在。在4°C下以300× g 离心5分钟。
   12. 在无菌生物安全柜下，弃去上清液并将隐窝沉淀重悬于补充有 10 μM Y27632 ROCK 抑制剂的 10 mL 冷 DMEMc 中。
   13. 将 10 μL 的隐窝溶液移液到 48 孔板中。在显微镜下以10倍放大倍率手动计算隐窝的数量，并计算每mL溶液的隐窝浓度。
       注意:分离的隐窝可以直接用于培养肠道类器官。然而，冷冻保存每头仔猪的大量隐窝并稍后将其用于类器官培养通常更方便。
3. 上皮隐窝冷冻
   1. 在 15 mL 锥形管中转移相当于 900 个隐窝的体积。在4°C下以300× g 离心5分钟。
   2. 弃去上清液并将隐窝沉淀重悬于1mL冷冻溶液中。转移到冷冻管中，将小瓶放入细胞冷冻容器中。
   3. 将细胞冷冻容器在-80°C下储存24小时，然后将小瓶转移到液氮中长期储存。

2. 冷冻上皮隐窝仔猪肠道三维类器官的建立

注意:仔猪肠道3D类器官在为人类类器官生长配制的商业培养基中培养，补充有1%P / S和100μg/ mL的原代细胞抗菌剂，并在4°C下储存长达1周。肿瘤来源的细胞外基质（ECM）用于3D类器官的培养。所有商业产品的参考文献均在 材料表中列出。

1. 材料准备
   1. 将移液器吸头置于-20°C（至少过夜）。
   2. 将ECM（500μL）的冷冻等分试样至少提前1小时置于4°C。
   3. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中预热48孔板。
   4. 将培养基置于室温下。
   5. 在37°C下预热水浴。
   6. 在无菌条件下在引擎盖下放置一个小冰桶。
2. 冷冻上皮隐窝解冻
   1. 在37°C（少于5分钟）的水浴中快速解冻含有900个冷冻隐窝的小瓶。
   2. 将隐窝溶液转移到 15 mL 锥形管中。
   3. 在室温下以300× g 离心5分钟。 取出上清液
   4. 加入 150 μL 带有冷却吸头的 ECM，以获得每 25 μL ECM 150 个隐窝的最终浓度。上下移液 10 次，以获得 ECM 中隐窝的均匀悬浮液。
      注意:始终将ECM放在冰上以避免聚合。始终在-20°C下使用预冷的移液器吸头来操作ECM。缓慢移液以避免在ECM中产生气泡。在此步骤中使用未稀释的ECM以防止小液滴塌陷。
   5. 在预热的 48 孔板中用冷却的吸头以每孔 25 μL 滴接种 6 个孔。
      注意:保持尖端垂直，在孔的中心，并在不引入空气的情况下缓慢移液以获得圆顶。这里使用48孔板，因为从冷冻隐窝开始时类器官数量通常较低。
   6. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育30分钟，用于ECM聚合。
   7. 在室温下每孔加入 250 μL 培养基。 在 37 °C、5% CO 2 培养箱中孵育，每_2-3 天更换培养基
      注意:解冻过程后，隐窝通常不可见，并且大多数细胞在ECM中解离（图2B）。

3. 来自冷冻隐窝的仔猪肠道3D类器官的通过

注意:从冷冻地穴获得类器官的时间通常比从新鲜地穴开始的时间长。类器官通常在解冻后10天准备好分裂（图2B）。

1. 材料准备
   1. 将ECM（500μL）的冷冻等分试样在4°C下放置至少1小时。
   2. 在37°C预热24孔板。
   3. 在37°C的水浴中预热PBS和补充有10μM Y27632 ROCK抑制剂的酶解离试剂。
   4. 将培养基置于室温下。
   5. 在无菌条件下在引擎盖下放置一个小冰桶。
2. 源自冷冻隐窝的3D类器官的传代
   1. 取出培养基，并在37°C下用250μL预热的PBS洗涤。
   2. 在每个孔中加入250μL预热的酶解离试剂，并在37°C下补充有10μM Y27632 ROCK抑制剂。
      注意:由于类器官数量少，类器官的解离直接在每个孔中进行。
   3. 用P1000移液管刮除ECM中的类器官，并通过移液五次仔细匀浆。
   4. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育5分钟。通过使用P1000移液管上下移液10次来解离细胞。
      注意:目标是获得分离的细胞或小细胞簇（<10个细胞）。在显微镜下验证解离。如果仍然观察到类器官的大片段，请重复步骤3.2.4。
   5. 在含有解离细胞的每个孔中加入 500 μL DMEMc，并在含有 3 mL 冷 DMEMc 的 15 mL 锥形管中汇集多达 12 个孔。
   6. 在4°C下以500× g 离心5分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL冷DMEMc中。
   7. 用细胞计数器在台盼蓝中以 1:2 的稀释度计数细胞。
      注意:自动细胞计数器可以对小簇中的细胞进行计数（如果存在）。
   8. 在4°C下以500× g 离心所需体积的细胞溶液，使其每个圆顶具有3，000个活细胞（24孔板的每个圆顶一个圆顶）5分钟。
   9. 在冰上每 3，000 个活细胞中用 17 μL 冷 DMEMc 重悬细胞。将体积调整到所需的孔数。
   10. 每 3，000 个活细胞缓慢加入 33 μL 带冷却吸头的冷 ECM，并在冰上匀浆而不产生气泡。将体积调整到所需的孔数。
       注意:将细胞重悬于含有1/3 DMEMc和2/3 ECM的溶液中。对于每个圆顶，需要 50 μL 该溶液。稀释的ECM更便宜，更容易移液。
   11. 在预热的 24 孔板中用冷却的吸头每孔用 50 μL ECM 细胞悬液接种孔。
   12. 在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育30分钟，用于ECM聚合。
   13. 每孔加入 500 μL 培养基。在37°C，5%CO 2培养箱中孵育，每_2-3 天更换培养基
       注意:类器官可以直接用于i）实验，ii）维持3D类器官培养，iii）冷冻或iv）类器官细胞单层的接种（图1）。每天用显微镜检查类器官的生长情况，以选择分裂类器官的最佳时间。类器官必须具有清晰空的管腔和清晰的边缘。不应使用管腔内有黑色碎片的成熟类器官进行分裂（图3）。

4. 维持类器官培养的3D效果

注意:对于传代，类器官应清晰且腔为空。分裂后约5天，管腔中出现黑色碎片，表明存在死细胞。在传代时限制死细胞的数量对于培养物的最佳维持是优选的。因此，应调整时间表，以避免达到这一成熟阶段。

1. 材料准备
   1. 将ECM（500μL）的等分试样置于4°C解冻至少1小时。
   2. 在37°C预热24孔板。
   3. 在37°C的水浴中预热补充有10μM Y27632 ROCK抑制剂的酶解离试剂。
   4. 将培养基置于室温下。
   5. 在无菌条件下在引擎盖下放置一个小冰桶。
2. 肠道3D类器官的通过
   1. 用 P1000 移液管刮擦，用 ECM 分离类器官。通过在培养基中移液小心均质，并转移到含有 5 mL 冷 DMEMc 的 15 mL 锥形管中。
      注意:一个 15 mL 锥形管用于在 24 孔板的 50 μL 圆顶中培养的 12 个类器官孔的池。
   2. 将收集的类器官在4°C下以500× g 离心5分钟。
      注意:类器官在管底部形成白色颗粒。如果离心后类器官仍在ECM中的悬浮液中，请小心吸出上清液（不接触ECM层），用P1000移液管移液10次均质化，然后重复离心步骤。在此过程之后，ECM 层应该不可见。
   3. 小心吸出上清液并将细胞沉淀重悬于补充有 10 μM Y27632 ROCK 抑制剂的预热酶解离试剂中。上下移液10次以启动类器官的解离。
   4. 在37°C水浴中孵育5分钟以进行酶消化。
   5. 通过使用 P1000 移液管移液 10 次来机械破坏类器官。在显微镜下检查细胞悬液。
      注意:目标是获得分离的细胞或小细胞簇。如果仍然观察到大的类器官片段，则重复孵育（步骤4.2.4）和机械破碎（步骤4.2.5）。
   6. 加入 4 mL 冰冷的 DMEMc。在4°C下以500× g 离心5分钟
   7. 弃去上清液并将类器官细胞沉淀重悬于 1 mL DMEMc 中。
   8. 如上所述（步骤3.2.7至3.2.13）进行计数细胞并将类器官细胞接种在预热的24孔板中含有3000个活细胞的50μLECM圆顶中。

5. 3D类器官的冷冻

1. 准备必要体积（1 mL 用于两个圆顶池）含有补充有 10% FBS、10% DMSO 和 10 μM Y27632 ROCK 抑制剂的 DMEMc 的冷冻溶液，并储存在冰上（最终 FBS 浓度为 18%）。
2. 从要冷冻的孔中取出培养基。
3. 将1mL冷冻溶液加入第一个要冷冻的孔中，通过刮擦分离ECM，并用移液管尖端匀浆。
4. 将类器官悬浮液从第一个孔转移到第二个孔中冷冻。
5. 将两个孔的池转移到冷冻管中，并将小瓶放入细胞冷冻容器中。
6. 将细胞冷冻容器在-80°C下储存24小时，然后将小瓶转移到液氮中长期储存。

6. 源自3D类器官的细胞单层培养

注意:猪类器官细胞的单层在2D培养基中培养，该培养基由补充有20%FBS的用于3D类器官的培养基组成。

1. 材料准备
   1. 准备 2D 介质并将其保持在 RT。
   2. 在37°C的水浴中预热补充有10μM Y27632 ROCK抑制剂的酶解离试剂。
2. 培养物插入物的涂层
   1. 对一把镊子进行消毒并将它们转移到生物安全柜中。
   2. 将细胞培养插入物（0.33cm²）放入带有镊子的24孔板中。
   3. 制备含有胶原蛋白IV的涂层溶液，在冷PBS中以50μg/ mL稀释。上下移液混合
   4. 向每个细胞培养插入片段中加入 150 μL 稀释的胶原蛋白 IV 溶液，相当于 22.7 μg/cm²。
      注意:小心地将移液管垂直定向到渗透膜的中心，并检查胶原蛋白溶液是否覆盖了所有膜。
   5. 将板置于37°C，5%CO₂ 培养箱中，放置过夜（或至少3小时）。
3. 将3D类器官细胞接种到细胞培养插入物中
   1. 从3D类器官制备细胞悬液，如步骤4.2.1至4.2.7中所述。
   2. 用细胞计数器在台盼蓝中以1:2的稀释度计数细胞，并计算每个培养插入片段接种2.5 x 10 5个细胞所需的体积，对应于7.6 x 10⁵个细胞/ cm²。
   3. 在4°C下以500× g 离心所需体积的细胞悬液5分钟。
   4. 在离心过程中，小心地从培养物中吸出包衣溶液，并在没有盖子的罩下室温干燥5分钟。
   5. 离心后，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于补充有10μM Y27632 ROCK抑制剂的所需体积的2D培养基中。每个插入片段需要 200 μL 含有细胞的 2D 培养基体积。
   6. 将 200 μL 细胞悬液（2.5 x 10⁵ 个细胞）接种到包被的透膜（顶端侧）（图 4A）。
      注意:在膜的中心缓慢移液并保持尖端垂直。
   7. 将 500 μL 补充有 10 μM Y27632 ROCK 抑制剂的 2D 培养基添加到下隔室（基底侧）。在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育。
   8. 播种一天后，用不含Y27632 ROCK抑制剂的新鲜2D培养基替换顶端和基底培养基。
   9. 每天更换 2D 介质。单层在接种后1天变得汇合，然后可用于实验。
      注意:空白（无细胞插入）上方的跨上皮电阻（TEER）值确认达到汇合度（图4B）。

7. 类器官细胞单层的免疫染色

1. 溶液的制备
   注意:根据要染色的孔数调整溶液的体积;一个孔的每个步骤都需要 200 μL 溶液。 材料表中提供了所有商业产品的参考资料。
   1. 通过将 5 mL 的 32% PFA 添加到 35 mL 的 PBS 中，在化学罩下制备 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液。准备10mL等分试样并储存在-20°C。
      注意:始终在化学罩下操作PFA，同时戴丁腈手套。
   2. 制备 0.2% Triton X100-PBS 的溶液，在使用前立即将 2 μL Triton X100 加入 1 mL PBS 中。保持在室温。
   3. 通过将 100 毫克 BSA 加入 1 mL PBS 中来制备 10% 牛血清白蛋白 （BSA）-PBS 溶液。保持在室温。
   4. 通过将 10 mg BSA 添加到 1 mL PBS 中来制备 1% BSA-PBS 溶液。保持在室温。
   5. 通过将 5 μL 一抗加入 995 μL 1% PBS BSA 中，制备以 1:200 稀释的封闭素一抗溶液。将溶液放在冰上。
   6. 通过将 1 μL 二抗加入 999 μL 1% BSA-PBS 中，制备以 1:1，000 稀释的二抗溶液。将溶液放在冰上，避光。
   7. 通过将 10 μL TRITC 以 1 mg/mL 加入 990 μL PBS 中，制备 10 μg/mL 的鬼笔环肽 TRITC 溶液。放在冰上，避光。
2. 免疫染色
   注意:除非另有说明，否则所有孵育均在室温下进行，在摇摆平台（30rpm）上缓慢搅拌。免疫染色直接在细胞培养插入物中进行。
   1. 去除基底和顶端培养基。将板放在化学罩下。
   2. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层两次并孵育 5 分钟。
   3. 在室温下用 200 μL 4% PFA 固定细胞单层，并在室温下孵育 20 分钟。
   4. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层两次并孵育 5 分钟。
      注意:在固定和洗涤步骤之后，单层可以在PBS中保持在4°C下1周。
   5. 取出 PBS，用 200 μL 0.2% Triton X100-PBS 透化，孵育 20 分钟。
   6. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层两次并孵育 5 分钟。
   7. 在 1% BSA-PBS 中加入 200 μL 一抗溶液，并在 4 °C 下孵育过夜，在摇动平台上缓慢搅拌。通过仅添加1%不含一抗的BSA-PBS来包括阴性对照孔。
   8. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层 3 次，并孵育 5 分钟。
   9. 在 1% BSA-PBS 中加入 200 μL 二抗，并在室温下孵育 2 小时，避光。
   10. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层 3 次，并孵育 5 分钟。
   11. 以 10 μg/mL 加入 200 μL 鬼笔环肽 TRITC 并孵育 10 分钟。
   12. 在室温下用 200 μL PBS 洗涤单层两次并孵育 5 分钟。
   13. 取出PBS并用手术刀切割膜。
   14. 用一把镊子恢复膜并将其放在显微镜载玻片上，顶端朝上。
   15. 直接在膜上以 1:1，000 的比例加入 15 μL 补充有 DAPI 的封片剂。放置盖玻片并密封。
   16. 储存在4°C，避光，直到成像。

结果

按照上述方案，从猪肠获得上皮隐窝并冷冻保存以在液氮中长期储存（图1和图2A）。解冻后，将隐窝干细胞接种在ECM中（图2B）。由于ECM中加密结构的分解，在此步骤之后，加密结构通常会丢失。类器官可以在3-4天内观察到，然后迅速生长并发育出芽结构（图2B）。我们在>80%的尝试中解冻冷冻隐窝后成功获得了类器官。解冻后约10天（根据类器官的生长速率），进行类器官传代以扩增培养物（图3）。类器官在分裂后生长更快，并且它们呈现出不同的形态，具有一些囊性和大多数出芽的类器官。为了最佳地维持培养物，用于传代的类器官必须呈现清晰空的管腔和清晰的边缘（用绿色箭头表示），管腔中没有黑色碎片（用红色箭头表示），如在成熟类器官中观察到的那样（图3）。我们发现黑细胞碎片在传代后第6天左右开始积聚。因此，建议在传代后第4-5天分裂或冷冻类器官。

类器官的成熟阶段也是获得细胞单层的重要点。具有高级成熟的类器官（由腔中存在黑细胞碎片表示）不是接种单层的最佳选择。我们通常在传代后4天解离3D类器官以收集细胞进行2D培养。需要大约一到三个以每50μL圆顶3，000个细胞培养的3D类器官孔，以接种一个具有2.5 x 10^5细胞的培养插入物。细胞在 1 天内附着并形成完全融合的单层（图 4A），这由约 700 Ω·cm² 的高 TEER 证实（图 4B）。然而，在这个早期时间点，细胞边缘很难通过明场显微镜可视化，可能是由于分化水平低。TEER 在 3 天内保持高位（图 4B）。

肌动蛋白染色表明上皮细胞的顶端侧朝向 3D 类器官中的管腔（图 5A）。接种在培养插入物中的类器官细胞形成汇合的单层上皮细胞，顶端朝向上室（图4B，C）。闭塞蛋白染色揭示了 3D 类器官和细胞单层中上皮细胞顶端侧存在紧密连接（图 5A-C）。

图 1:用于培养源自类器官的 3D 类器官和细胞单层的方法示意图。 上皮隐窝从仔猪肠中分离出来。这些隐窝可以i）立即用于培养3D类器官或ii）冷冻并储存在液氮中的生物库中。冷冻保存的隐窝可以解冻并用于培养3D类器官。3D类器官培养物可以通过连续分裂来维持，或冷冻并储存在生物库中。可以从3D类器官培养中获得细胞单层，以允许进入细胞的顶端侧并研究上皮屏障功能。 请点击此处查看此图的大图。

图2:从冷冻保存的上皮隐窝培养猪肠道3D类器官。 （A）新鲜分离的空肠隐窝的代表性显微图像。（B）空肠隐窝解冻后获得的3D类器官的代表性显微图像。将类器官培养在 48 孔板中的 25 μL ECM 圆顶中。该图显示了接种后 4、7、8、9 和 10 天时 3D 类器官的图像。比例尺代表 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:第一次传代后从冷冻保存的上皮隐窝衍生的猪肠道 3D 类器官的形态。 代表性的显微图像显示了从第4天到第7天第一次传代后从冷冻保存的空肠隐窝衍生的类器官的发育。绿色箭头表示适合单层传代或接种的透明类器官。红色箭头表示不适合分裂或接种单层的成熟类器官;因此，应在这种形态出现之前使用孔。比例尺代表 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图4:源自猪肠道3D类器官的细胞单层的特征 。 （A）3天内单层形态的代表性显微图像。将空肠类器官细胞以2.5 x 10⁵ 个细胞接种到0.33 cm² 细胞培养插入物中，以50 ng / mL的速度涂有胶原蛋白IV。比例尺代表 500 μm。 （B） 类器官细胞单层在 3 天内的跨上皮电阻 （TEER）。由线连接的点在不同时间对应于同一孔。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:以 3D 或 2D 培养的猪空肠类器官的成像。（A）分裂后5天的3D类器官和（B，C）接种后3天的类器官细胞单层的共聚焦显微镜成像（B:XZ切片;C:XY部分）。DNA（蓝色）用DAPI染色。肌动蛋白（红色）用鬼笔环肽染色。用多克隆抗体染色奥克卢定（绿色）。白色箭头表示奥塞定位于紧密连接处。比例尺代表 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

该协议描述了一种用于冷冻保存仔猪肠上皮隐窝的方法，用于长期储存和随后培养3D类器官。该方案使用含有DMSO，FBS，Y27632 ROCK抑制剂，DMEM和抗生素的冷冻溶液。另一项针对猪的研究从冷冻保存在类似冷冻溶液中的隐窝中获得类器官，但没有 ROCK 抑制剂¹⁵。包括Y27632 ROCK抑制剂以防止细胞凋亡并维持干细胞库，因为在解冻后，上皮隐窝细胞被解离，这可能导致细胞死亡（'anoikis'）^27，28。有趣的是，马肠样是从仅含有DMEM和DMSO¹⁶的培养基中冷冻的上皮隐窝中获得的;这种简单的方法尚未针对猪上皮隐窝进行测试。已经发表了其他方法，以从冷冻组织或活检而不是上皮隐窝中培养人类和猪类器官4^，17。这种方法的优点是能够直接冷冻保存肠道组织，而无需执行需要时间和实验室设备的隐窝分离程序。当组织必须在远离实验室的地方收集时，这可能很方便。然而，当在屠宰后立即分离隐窝时，可以处理大段肠以获得非常大量的隐窝，而从小的冷冻组织碎片开始时则不是这种情况。上皮隐窝解冻后，在播种后3-4天观察到类器官，并在10天后分裂。这比从新鲜上皮隐窝开始培养时生长速度慢，后者的类器官是从接种后第 1 天获得的，通常可以在第 5¹¹ 天左右分裂。Khalil等人还报告说，当从冷冻的隐窝¹⁵开始时，猪肠样的生长延迟，这表明干细胞可能需要时间来恢复其增殖能力。与新鲜隐窝相比，从冷冻隐窝开始时，我们还获得了较少数量的类器官，这可能是由于冷冻过程中干细胞的死亡。在一些隐窝解冻的尝试中（<20%），我们没有从冷冻的隐窝中获得类器官，可能是由于冷冻保存程序欠佳（例如，隐窝分离后冷冻延迟超过1小时）。因此，我们建议将地下室放在冰上直到计数，并尽快冷冻它们。

对于3D类器官，我们选择使用为人类配制的商业类器官培养基。事实上，以前的报告表明，猪肠道类器官在^这种培养基8，¹¹，¹⁴，¹⁹，²⁵，²⁶，^29，30下有效生长。该培养基是即用型培养基，并且在批次中具有标准化的生长因子浓度，这是令人感兴趣的。然而，这种培养基成本高昂，其成分未公开，因此不可能调节其组成。相比之下，其他研究在含有药理抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基⁵、⁶、^7、21 的定制培养基中培养猪肠道类器官。尽管该方法具有高度的灵活性和成本，但对于条件培养基的生产非常耗时，并且由于条件培养基中生长因子浓度的潜在变化，该方法可能缺乏可重复性。因此，应通过测量类器官生长或标记基因表达来验证每批条件培养基的质量³¹。

一项研究表明，与使用含有重组生长因子和/或条件培养基的培养基培养的猪空肠类器官相比，在这里使用的相同商业类器官培养基中培养的猪空肠类器官生长更快，并且似乎分化程度较低²³。高增殖状态有助于 3D 类器官的培养，但可能需要诱导分化以更能代表肠道生理特征。在该协议中，对于3D类器官的传代，细胞完全解离以进行计数，从而可以控制ECM中接种的细胞数量。这增加了类器官表型的可重复性，而表型受其密度的高度影响。此外，计数细胞可避免培养物过低或过度拥挤，这需要调整培养方案。大多数其他研究制备了未完全解离为单个细胞的类器官片段，并使用稀释比进行传代。这种方法更直接，但可能会根据培养物的类器官密度引起变异性。

对于单层培养，类器官细胞接种在预涂有薄层ECM的培养插入物中，允许细胞附着，但避免类器官在3D中生长。该方案使用IV型胶原蛋白作为ECM蛋白，如之前在猪²³中所述。其他猪类器官单层研究使用与此处相同的肿瘤衍生ECM来培养3D类器官⁶，⁸，⁹，²¹，^25，30。使用胶原蛋白的优点是能够用完全定义的组成标准化蛋白质浓度，这在肿瘤来源的ECM中并非如此。细胞单层培养成功的关键步骤是注意前体3D类器官的视觉外观，其应具有清晰的边缘和没有黑色碎片的空腔。事实上，具有高成熟水平和低增殖率的类器官不是2D培养的合适细胞来源。因此，将3D类器官解离成单细胞的时间对于此步骤的成功至关重要。

从单个细胞培养2D单层可以标准化接种的细胞数量，这在从类器官片段开始时更加困难，就像在其他一些方法中一样。我们接种了7.6 x 10 5个细胞/cm 2，与大多数其他研究21，22^，23相比，在使用较低细胞密度的猪中接种，范围从^0.25 x 10⁵个细胞每cm 2到1.78 x 10⁵个细胞/cm ²。大量类器官细胞的需求构成了该协议的局限性，但它使我们能够快速获得融合的单层，在1天后完全覆盖培养插入物。相反，Vermeire等人23在接种细胞密度较低（从^0.25 x 10 5个细胞/cm 2到0.4 x 10⁵个细胞/cm ²）的4-7天后获得汇合度。一些研究还使用了猪类器官细胞单层，这些单层不能完全覆盖病毒^8，30感染的培养表面。在这些条件下，上皮细胞的顶端可以进行处理，但如果目的是研究营养吸收或上皮通透性，则需要完全融合的单层。

对于类器官细胞单层，根据最近对牛肠源性单层的研究，使用了补充有20%FBS的商业类器官培养基³²。在我们的测试中，补充20%FBS对于获得完全融合的单层是必要的，可能是由于高生长因子要求。相反，使用相同商业培养基的其他研究已经建立了没有额外FBS⁸，²⁵，³⁰的单层^，但没有达到完全汇合。其他研究也使用在定制培养基中补充20%FBS用于培养猪类器官细胞单层^21，22。在我们的实验中，TEER 在播种后 1 天（约 700 Ω·cm 2）很高，直到第 3 天（约 1，500 Ω·cm²）保持高水平;这与紧密连接的形成一致，如闭塞素的表达所示。Van der Hee等人在72小时内获得了空肠类器官细胞单层²¹的相似TEER值。他们还证明，单层可以维持到第12-15天，每天更换培养基。相比之下，其他研究报告了猪类器官细胞^单层的TEER值要低得多（约200 Ω·cm²）6^，22。研究之间的这些差异可能与所研究的肠道段或影响上皮分化的培养基有关。

总之，上述从冷冻上皮隐窝生长猪肠道3D类器官的方案有助于组织培养工作。它减少了从活体动物身上获得新鲜组织的需求。我们还解释了如何在不到3天的时间内建立来自猪类器官的完全融合的细胞单层。因此，我们的协议可能是科学家研究猪肠上皮用于兽医或生物医学研究的有用资源。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Store at room temperature.
15 mL conical tube	Sarstedt	62.554.502
24-well cell culture plate	Corning	003526
48-well cell culture plate	Corning	003548
50 mL polypropylene conical tube	Falcon	352070
Bovine Serum Albumine (BSA)	Euromedex	A6003	Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R	Hettich	1406
Collagene type IV from human placenta	Sigma	C5533	Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	432003	Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm	VWR	630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL	Clear line	390706	Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI	Invitrogen	D1306	Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT)	Merck	10197777001	Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	31966047	Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25-950-CQC	Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide	VWR	631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22363549	Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator	VWR	97025-564	Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010015	Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific	12605-010	Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008	Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell Technology	6010	Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells	Corning	353095
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectashield	H1250	Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	71-1500	Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32%	Electron microscopy science	15714	Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC	Sigma	P1951	Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632)	ATCC	ACS-3030	Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL	Clear line	062646CL	Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL	Corning	4488
Tissue Culture Dish	TPP	93100
Triton X100	Sigma	8787	Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282	Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip	Integra	159000	Used to remove the medium of organoid wells.