냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

요약

여기에서는 냉동보존된 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 확립하여 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다.

초록

장 오가노이드는 소화기 질환 모델링을 위해 장 상피를 연구하거나 약물, 영양소, 대사 산물, 병원체 및 미생물군과의 상호 작용을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 장내 오가노이드를 배양하는 방법은 이제 돼지를 포함한 여러 종에 사용할 수 있으며, 돼지는 농장 동물로서 그리고 예를 들어 인수공통전염병을 연구하기 위한 인간의 번역 모델로서 주요 관심 종입니다. 여기에서는 냉동 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 데 사용되는 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 돼지 장에서 상피 선와를 냉동 보존하는 방법과 3D 장 오가노이드를 배양하기 위한 후속 절차를 설명합니다. 이 방법의 주요 장점은 (i) 3D 오가노이드 배양에서 스크립트 분리의 시간적 해리, (ii) 여러 장 세그먼트 및 여러 동물에서 한 번에 파생된 냉동 보존된 크립트의 대량 준비, 따라서 (iii) 살아있는 동물에서 신선한 조직을 샘플링할 필요성의 감소. 우리는 또한 영양소, 미생물 또는 약물과의 상호 작용 부위인 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 설정하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 전반적으로 여기에 설명된 프로토콜은 수의학 및 생물의학 연구에서 돼지 장 상피를 연구하는 데 유용한 리소스입니다.

서문

장 상피는 내강 환경과의 경계면에서 소화 점막을 덮는 세포의 단층에 의해 형성됩니다. 이 위치는 줄기 세포와 여러 분화된 상피 세포 유형(흡수성, 장내분비 세포, 파네스 세포 및 잔 세포)의 존재에 의해 뒷받침되는 영양소 흡수 및 장벽 기능과 같은 다양한 기능과 관련이 있습니다¹. 전통적으로 상피 세포 연구에 사용되는 불멸화 세포주는 장 상피의 세포 복잡성을 반영하지 않고 게놈 이상을 나타내기 때문에 큰 한계가 있다². Sato et al.3에 의한 ³ 차원(3D) 오가노이드의 개발은 생리학적 관련성이 개선된 장 상피를 연구하기 위한 새로운 모델을 제공했습니다. 실제로, 장 오가노이드는 형질전환되지 않은 줄기 세포에서 유래하고 여러 세포 유형으로 구성되며 장 상피의 기능을 요약합니다. 장 오가노이드는 장 상피의 발달과 기능, 그리고 병원체, 영양소, 독소, 약물, 미생물군, 대사산물과의 상호작용을 이해하는 데 점점 더 많이 사용되고 있다².

처음에는 인간과 생쥐를 위해 개발되었으나 장내 오가노이드 배양에 사용된 방법은 최근 돼지를 포함한 다른 종에도 적용되었다⁴. Gonzales et ^al.5는 공장으로부터 돼지 오가노이드를 최초로 배양하였다. 그 이후로, 돼지 오가노이드는 다른 장 분절(십이지장, 회장 및 결장)에 대해 설명되었으며^6,7,8, 위치 특이적 표현형 9,10,11을 유지하는 것으로 나타났습니다. 돼지 장내 3D 오가노이드는 현재 영양소^12,13 또는 장 감염 6,8,14의 효과를 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다.

대부분의 연구는 갓 분리된 상피 선와에서 시작하는 장 오가노이드의 배양을 설명했습니다. 그러나 이것은 특히 돼지와 같은 큰 동물과 함께 작업할 때 물류상의 이유로 항상 실현 가능한 것은 아닙니다. 실제로 돼지를 위한 동물 시설은 오가노이드를 배양하는 실험실에서 멀리 떨어져 있어 작업 조직이 복잡해집니다. 또한 오가노이드 배양은 시간이 많이 걸립니다. 따라서 예를 들어 서로 다른 장 분절 또는 여러 동물에서 여러 오가노이드 계통을 동시에 성장시키는 것은 실용적이지 않습니다. 이러한 문제를 피하기 위해 인간, 말 및 돼지를 대상으로 한 몇 가지 연구에서는 냉동 장 조직(또는 생검) 또는 분리된 상피 선와에서 오가노이드를 배양하는 방법을 설명했습니다 4,15,16,17. 이러한 방법을 사용하면 단일 동물의 여러 장 부분에서 장 상피 줄기 세포를 냉동 보존할 수 있으며, 필요할 때 오가노이드를 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이것은 줄기 세포의 기증자로 사용되는 살아있는 동물의 수를 크게 감소시킬 수 있는데, 이는 냉동 보존 된 크립트의 대량 재고가 생성 될 수 있기 때문입니다 (3R의 원리). 이 방법의 또 다른 장점은 표현형 또는 유전형 결과를 얻은 후 관심 동물에서만 장 오가노이드가 성장한다는 것인데, 이는 매우 비용 효율적입니다.

생체 내에서, 장 상피 세포는 분극화되고, 정점면은 내강을 향한다. 시험관 내, 3D 오가노이드에서 상피 세포의 정점 측면도 내강(즉, 오가노이드 ^내부)을 향하고 있습니다4. 이 조직은 상피 세포에 대한 내강 성분(예: 영양소, 미생물, 대사 산물)의 영향을 연구할 때 문제가 되는 정점 측면에 대한 접근을 방지합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 오가노이드 세포를 2D 단층으로 배양, 미세주입 및 극성 반전("apical-out organoid")과 같은 여러 방법이 개발되었습니다^18,19. 오가노이드 세포 단층의 배양은 가장 효율적이고 다루기 쉬운 시스템으로 부상하고 있습니다. 원리는 3D 오가노이드를 단일 세포로 분리하고 이전에 세포외 기질(ECM)²⁰의 얇은 층으로 코팅된 세포 배양 용기에 시드하는 것입니다. 이러한 배양 조건에서, 상피 세포의 정점 측면은 위쪽을 향하고 있으며, 따라서 실험적 처리에 접근할 수 있다²⁰. 오가노이드 세포 단층의 배양은 최근 돼지 장^21,22에 적응되었습니다. 돼지 3D 오가노이드에서 유래한 세포 단 층은 장 감염 연구 6,23,24,25^, 영양소 수송^{연구 9}, 소화기 질환 모델링 ²⁶ 등 다양한 용도로 사용되어 왔다.

여기에서 이 연구는 먼저 냉동보존된 상피 선와에서 파생된 돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 유지를 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 그런 다음 돼지 장 3D 오가노이드에서 세포 단층을 확립하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 여기에 설명된 방법은 영양소 수송, 장벽 기능 및 숙주-미생물 상호 작용에 대한 돼지 장 상피를 연구하는 데 사용할 수 있는 실험 도구를 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침(2010/63/EU)에 따라 지역 윤리 위원회(N°TOXCOM/0136/PP)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 공장을 예로 들어 설명하지만 소장과 대장의 각 부분(십이지장, 공장, 회장, 결장)에 사용할 수 있습니다.

1. 새끼 돼지 장에서 상피 선와를 분리합니다

참고: 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 보충된 DMEM으로 완전한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEMc) 재고를 준비합니다. 분취량 50mL를 준비하고 4°C에서 1개월 동안 보관합니다.

1. 용액 준비 (crypt 격리 당일에 이루어짐)
   1. 인산염 완충 식염수(PBS), 3mM 디티오트레이톨(DTT), 9mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 10μM Y27632 ROCK 억제제 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 포함하는 해리 용액을 준비하고 얼음에 보관합니다.
   2. DMEMc, 10% FBS, 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 10 μM Y27632 ROCK 억제제를 함유하는 동결 용액을 준비하고, 얼음 상에 저장한다(최종 FBS 농도는 18%).
   3. 1% P/S가 보충된 차가운 PBS가 포함된 수송 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오.
2. 상피 선와(epithelial crypt)의 분리
   1. electronarcosis에 의해 새끼 돼지를 도살하고 방혈을 일으킨다.
   2. 도축 직후, 메스로 새끼 돼지의 복부를 열고 전체 내장을 제거하십시오.
   3. 약 2cm의 장 부분을 모아 차가운 수송 용액에 보관하십시오. 지하실이 격리될 때까지 세그먼트를 얼음 위에 두십시오(최대 2시간).
   4. 티슈를 페트리 접시에 담습니다. 장 분절을 세로로 열고 1% P/S가 보충된 차가운 PBS로 조직을 조심스럽게 씻어 장 내용물을 제거합니다.
   5. 1% P/S가 보충된 차가운 PBS 10mL로 채워진 새 페트리 접시에 조직을 옮깁니다.
   6. 핀셋으로 조직을 잡고 현미경 슬라이드로 긁어 융모와 남은 점액을 제거합니다.
      참고: 융모(혀 모양 구조)의 제거는 상층액을 현미경으로 관찰하여 확인할 수 있습니다.
   7. 조직을 5mL의 얼음처럼 차가운 해리 용액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 회전 셰이커(15rpm)에서 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
   8. 조직을 새 페트리 접시에 옮기고 1% P/S가 보충된 차가운 PBS 10mL를 추가합니다.
   9. 현미경 슬라이드로 점막을 단단히 긁어 음와를 기계적으로 분리합니다.
      참고: 현미경으로 PBS에서 상피 선와가 있는지 확인합니다(그림 2A).
   10. 혈청학적 피펫으로 크립트 용액을 흡인하고 50mL 원뿔형 튜브에서 100μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.
   11. 용액 10 μL를 피펫으로 세척하고, 현미경으로 크립트의 존재를 확인한다. 4 °C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
   12. 멸균 생물 안전 캐비닛 아래에서 상청액을 버리고 10μM Y27632 ROCK 억제제가 보충된 10mL의 차가운 DMEMc에 크립트 펠릿을 재현탁합니다.
   13. 크립트 용액 10 μL를 48-웰 플레이트에 피펫한다. 10x 배율로 현미경으로 스크립트 수를 수동으로 계산하고 용액 mL당 크립트 농도를 계산합니다.
       참고: 분리된 크립트는 장 오가노이드를 배양하는 데 직접 사용할 수 있습니다. 그러나 각 새끼 돼지에서 대량의 크립트를 냉동 보존하고 나중에 오가노이드 배양에 사용하는 것이 더 편리한 경우가 많습니다.
3. 상피 선와(epithelial crypt)의 동결
   1. 15mL 원뿔형 튜브에 900개의 크립트에 해당하는 부피를 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
   2. 상청액을 버리고 냉동 용액 1mL에 크립트 펠릿을 다시 현탁합니다. cryotube로 옮기고 바이알을 세포 동결 용기에 넣습니다.
   3. 세포 동결 용기를 -80°C에서 24시간 동안 보관한 다음 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관합니다.

2. 냉동 상피 선와에서 자돈 장 3D 오가노이드 확립

참고: 새끼 돼지 장내 3D 오가노이드는 인간 오가노이드의 성장을 위해 제조된 상업용 배양 배지에서 배양되고, 일차 세포용 항균제 1% P/S 및 100μg/mL가 보충되고, 최대 1주일 동안 4°C에서 보관됩니다. 종양 유래 세포외 기질(ECM)은 3D 오가노이드 배양에 사용됩니다. 상용 제품에 대한 모든 참조는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 재료 준비
   1. 피펫 팁을 -20°C(적어도 밤새)에 놓습니다.
   2. ECM의 분취량(500 μL)을 4°C에서 적어도 1시간 전에 미리 동결시켰다.
   3. 48-웰 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 예열하였다.
   4. 배양 배지를 RT에 놓습니다.
   5. 37 °C에서 수조를 예열합니다.
   6. 무균 상태에서 후드 아래에 작은 얼음 양동이를 놓습니다.
2. 얼어 붙은 상피 선와를 해동합니다
   1. 900개의 냉동 크립트가 들어 있는 바이알을 37°C의 수조(5분 미만)에서 빠르게 해동합니다.
   2. 크립트 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   3. RT에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다
   4. 냉각된 팁과 함께 ECM 150μL를 추가하여 ECM 25μL당 150크립트의 최종 농도를 얻습니다. ECM에서 스크립트의 균질한 현탁액을 얻기 위해 위아래로 10회 피펫.
      알림: 중합을 피하기 위해 ECM을 항상 얼음 위에 두십시오. ECM을 조작하려면 항상 -20°C에서 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하십시오. ECM에 기포가 생기지 않도록 천천히 피펫을 피하십시오. 이 단계에서는 작은 방울이 무너지는 것을 방지하기 위해 희석되지 않은 ECM이 사용됩니다.
   5. 미리 예열된 48웰 플레이트에서 냉각된 팁으로 웰당 25μL 드롭으로 6개의 웰을 시드합니다.
      알림: 팁을 우물 중앙에 수직으로 유지하고 돔을 얻기 위해 공기를 유입시키지 않고 천천히 피펫합니다. 여기서는 48웰 플레이트가 사용되는데, 이는 냉동 크립트에서 시작할 때 오가노이드 수가 일반적으로 낮기 때문입니다.
   6. ECM의 중합을 위해 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   7. RT에서 배양 배지의 웰 당 250 μL를 첨가하고, 37°C, 5%_CO2 배양기에서 배양하고, 배양 배지를 2-3일마다 교환한다
      참고: 크립드는 일반적으로 해동 절차 후에 보이지 않으며 대부분의 세포는 ECM에서 해리됩니다(그림 2B).

3. 냉동 크립트에서 유래한 새끼 돼지 장 3D 오가노이드의 통과

참고: 냉동 지하실에서 오가노이드를 얻는 시간은 일반적으로 신선한 지하실에서 시작할 때보다 더 깁니다. 오가노이드는 일반적으로 해동 후 10일 후에 분해할 준비가 되어 있습니다(그림 2B).

1. 재료 준비
   1. ECM의 동결 분취량(500 μL)을 4°C에서 적어도 1시간 동안 놓는다.
   2. 24-웰 플레이트를 37°C에서 예열한다.
   3. PBS 및 효소 해리 시약을 10 μM Y27632 ROCK 억제제로 보충된 수조에서 37°C의 수조에서 예비-가온하였다.
   4. 배양 배지를 RT에 놓습니다.
   5. 무균 상태에서 후드 아래에 작은 얼음 양동이를 놓습니다.
2. 얼어붙은 지하실에서 파생된 3D 오가노이드의 통과
   1. 배양 배지를 제거하고 37°C에서 예열된 PBS 250μL로 세척합니다.
   2. 37°C에서 10μM Y27632 ROCK 억제제로 보충된 예열 효소 해리 시약 250μL를 각 웰에 추가합니다.
      참고: 오가노이드의 수가 적기 때문에 오가노이드의 해리는 각 웰에서 직접 수행됩니다.
   3. P1000 피펫으로 긁어서 ECM의 오가노이드를 분리하고 5회 피펫팅하여 조심스럽게 균질화합니다.
   4. 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 5분 동안 인큐베이션한다. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 10회 피펫팅하여 세포를 해리합니다.
      참고: 목표는 분리된 셀 또는 작은 셀 클러스터(<10개 셀)를 얻는 것입니다. 현미경으로 해리를 확인합니다. 오가노이드의 큰 조각이 여전히 관찰되면 3.2.4단계를 반복합니다.
   5. 해리된 세포가 들어 있는 각 웰에 DMEMc 500μL를 추가하고, 차가운 DMEMc 3mL가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브에 최대 12개의 웰을 모읍니다.
   6. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 차가운 DMEMc 1mL에 재현탁합니다.
   7. 세포 계수기를 사용하여 Trypan blue에서 1:2로 희석하여 세포를 계산합니다.
      알림: 자동 셀 카운터는 작은 클러스터 내의 셀(있는 경우)을 계산할 수 있습니다.
   8. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 돔 당 3,000개의 살아있는 세포(24-웰 플레이트의 웰 당 하나의 돔)를 갖도록 필요한 부피의 세포 용액을 원심분리한다.
   9. 얼음 위의 살아있는 세포 3,000개당 17μL의 차가운 DMEMc로 세포를 재현탁합니다. 필요한 수의 우물로 볼륨을 조정하십시오.
   10. 3,000개의 살아있는 세포당 냉각된 팁이 있는 33μL의 차가운 ECM을 천천히 추가하고 기포를 만들지 않고 얼음에서 균질화합니다. 필요한 수의 우물로 볼륨을 조정하십시오.
       참고: 세포는 1/3 DMEMc 및 2/3 ECM을 포함하는 용액에 재현탁됩니다. 각 돔에 대해 50μL의 이 용액이 필요합니다. 희석된 ECM은 더 저렴하고 피펫팅하기 쉽습니다.
   11. 웰 당 50 μL의 ECM 세포 현탁액으로 웰을 미리 예열 된 24 웰 플레이트에서 냉각 된 팁으로 시딩합니다.
   12. ECM의 중합을 위해 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   13. 웰당 500 μL의 배양 배지를 추가합니다. 37°C, 5%_CO2 배양기에서 배양하고 2-3일마다 배양액을 교체합니다
       참고: 오가노이드는 i) 실험, ii) 3D 오가노이드 배양 유지, iii) 동결 또는 iv) 오가노이드 세포 단층의 파종에 직접 사용할 수 있습니다(그림 1). 매일 현미경으로 오가노이드의 성장을 확인하여 오가노이드 분할을 위한 최적의 시기를 선택합니다. 오가노이드는 깨끗하고 비어 있는 루멘과 잘 정의된 가장자리를 가져야 합니다. 루멘에 검은색 파편이 있는 성숙한 오가노이드는 분할에 사용해서는 안 됩니다(그림 3).

4. 오가노이드 배양의 3D 유지

알림: 통과의 경우 오가노이드는 빈 내강으로 투명하게 나타나야 합니다. 검은 파편은 분열 후 약 5 일 후에 내강에 나타나며 죽은 세포의 존재를 나타냅니다. 계대시의 죽은 세포의 수를 제한하는 것이 배양의 최적 유지를 위해 바람직합니다. 따라서 이 성숙 단계에 도달하지 않도록 일정을 조정해야 합니다.

1. 재료 준비
   1. ECM의 분취량(500 μL)을 4°C에서 최소 1시간 동안 해동하도록 배치합니다.
   2. 24-웰 플레이트를 37°C에서 예열한다.
   3. 10 μM Y27632 ROCK 억제제로 보충된 효소 해리 시약을 37°C의 수조에서 예열하였다.
   4. 배양 배지를 RT에 놓습니다.
   5. 무균 상태에서 후드 아래에 작은 얼음 양동이를 놓습니다.
2. 장 3D 오가노이드의 통과
   1. P1000 피펫으로 긁어 ECM으로 오가노이드를 분리합니다. 배양 배지에서 피펫팅하여 조심스럽게 균질화하고 얼음 위의 5mL의 차가운 DMEMc가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      참고: 15웰 플레이트의 50μL 돔에서 배양된 12웰의 오가노이드가 있는 풀에는 15mL 원뿔형 튜브 1개가 필요합니다.
   2. 수집된 오가노이드를 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.
      참고: 오가노이드는 튜브 바닥에 흰색 펠릿을 형성합니다. 오가노이드가 원심분리 후 ECM의 현탁액에 여전히 남아 있는 경우 상부 상층액을 조심스럽게 흡인하고(ECM 층을 건드리지 않고) P1000 피펫으로 10회 피펫팅하여 균질화하고 원심분리 단계를 반복합니다. 이 절차 후에는 ECM 레이어가 표시되지 않아야 합니다.
   3. 상층액을 조심스럽게 흡인하고 10μM Y27632 ROCK 억제제가 보충된 예열 효소 해리 시약 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 오가노이드의 해리를 시작하기 위해 위아래로 10번 피펫.
   4. 효소 소화를 위해 37°C 수조에서 5분 동안 배양합니다.
   5. P1000 피펫으로 10회 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 파쇄합니다. 현미경으로 세포 현탁액을 확인하십시오.
      참고: 목표는 분리된 셀 또는 작은 셀 클러스터를 얻는 것입니다. 큰 오가노이드 단편이 여전히 관찰되면 인큐베이션(단계 4.2.4)과 기계적 파쇄(단계 4.2.5)를 반복합니다.
   6. 얼음처럼 차가운 DMEMc 4mL를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리기
   7. 상층액을 버리고 오가노이드 세포 펠릿을 DMEMc 1mL에 재현탁합니다.
   8. 상술한 바와 같이(단계 3.2.7 내지 3.2.13) 진행하여 세포를 계수하고 예열된 24웰 플레이트에서 3000개의 살아있는 세포를 포함하는 ECM 돔의 50μL에 오가노이드 세포를 시딩합니다.

5. 3D 오가노이드의 동결

1. 10% FBS, 10% DMSO 및 10μM Y27632 ROCK 억제제가 보충된 DMEMc를 함유하는 동결 용액의 필요한 부피(2개의 돔 풀에 대해 1mL)를 준비하고 얼음에 보관합니다(최종 FBS 농도는 18%).
2. 냉동될 웰로부터 배양 배지를 제거한다.
3. 동결할 첫 번째 웰에 냉동 용액 1mL를 넣고 긁어서 ECM을 분리한 다음 피펫 팁으로 균질화합니다.
4. 오가노이드 현탁액을 첫 번째 웰에서 두 번째 웰로 옮겨 동결시킵니다.
5. 두 웰의 풀을 cryotube로 옮기고 바이알을 세포 동결 용기에 넣습니다.
6. 세포 동결 용기를 -80°C에서 24시간 동안 보관한 다음 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관합니다.

6. 3D 오가노이드에서 유래한 세포 단층의 배양

참고: 돼지 오가노이드 세포의 단층은 2% FBS가 보충된 3D 오가노이드에 사용되는 배양 배지로 구성된 20D 배지에서 배양됩니다.

1. 재료 준비
   1. 2D 매체를 준비하고 RT로 유지하십시오.
   2. 10 μM Y27632 ROCK 억제제로 보충된 효소 해리 시약을 37°C의 수조에서 예열하였다.
2. 배양 삽입물의 코팅
   1. 핀셋 한 켤레를 소독하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
   2. 세포 배양 삽입물(0.33^cm2)을 핀셋으로 24웰 플레이트에 넣습니다.
   3. 차가운 PBS에서 50μg/mL로 희석된 콜라겐 IV를 포함하는 코팅 용액을 준비합니다. 피펫을 위아래로 섞어
   4. 희석된 콜라겐 IV 용액 150μL을 각 세포 배양 삽입물에 추가하며, 이는 22.7μg/^cm2에 해당합니다.
      알림: 피펫을 투과성 멤브레인의 중앙에 수직으로 조심스럽게 향하게 하고 콜라겐 용액이 모든 멤브레인을 덮는지 확인합니다.
   5. 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 넣고 밤새(또는 최소 3시간 동안) 방치합니다.
3. 3D 오가노이드 세포를 세포 배양 삽입물에 시딩
   1. 단계 4.2.1 내지 4.2.7에 기재된 바와 같이 3D 오가노이드로부터 세포 현탁액을 준비한다.
   2. 세포 계수기를 사용하여 Trypan blue에서 1:2로 희석한 세포를 세고 7.6 x 10 5 cells/^cm2에 해당하는 배양 삽입물당 2.5 x 10^{5 세포를 시}드하는 데 필요한 부피를 계산합니다.
   3. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 필요한 부피의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   4. 원심분리하는 동안 배양 삽입물에서 코팅 용액을 조심스럽게 흡인하고 뚜껑 없이 후드 아래의 RT에서 5분 동안 건조시킵니다.
   5. 원심분리 후, 상층액을 버리고 10μM Y27632 ROCK 억제제가 보충된 필요한 부피의 2D 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 포함하는 2D 배지의 200 μL의 부피가 각 삽입물에 필요합니다.
   6. 200 μL의 세포 현탁액(2.5 x 10⁵ 세포)을 코팅된 투과성 막(정점 측면) 상에 시드한다(도 4A).
      알림: 멤브레인 중앙에서 천천히 피펫을 피펫하고 팁을 수직으로 유지합니다.
   7. 10μM Y27632 ROCK 억제제가 보충된 500μL의 2D 배지를 하부 구획(기저부)에 추가합니다. 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양한다.
   8. 파종 후 하루 만에 정점 및 기저 배지를 Y27632 ROCK 억제제가 없는 새로운 2D 배지로 교체합니다.
   9. 매일 2D 매체를 교체하십시오. 단층은 파종 후 1일 후에 합류하게 되며 실험에 사용할 수 있습니다.
      참고: 블랭크(셀 없이 삽입) 위의 경상피 전기 저항(TEER) 값은 밀도에 도달했음을 확인합니다(그림 4B).

7. 오가노이드 세포 단층의 면역염색

1. 용액 준비
   알림: 염색할 웰의 수에 따라 용액의 부피를 조정하십시오. 하나의 웰에 대해 각 단계에서 200 μL의 용액이 필요합니다. 모든 상용 제품에 대한 참조는 재료 표에 나와 있습니다.
   1. 35mL의 PBS에 5mL의 32% PFA를 첨가하여 화학 후드 아래에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다. 분취량 10mL를 준비하고 -20°C에서 보관한다.
      주의 : 항상 니트릴 장갑을 끼고 화학 후드 아래에서 PFA를 조작하십시오.
   2. 사용 직전에 1mL의 PBS에 2μL의 Triton X100을 첨가하여 0.2% Triton X100-PBS 용액을 준비합니다. RT에서 유지하십시오.
   3. PBS 1mL에 BSA 100mg을 첨가하여 10% 소혈청알부민(BSA)-PBS 용액을 준비합니다. RT에서 유지하십시오.
   4. 1mL의 PBS에 10mg의 BSA를 첨가하여 1% BSA-PBS 용액을 준비합니다. RT에서 유지하십시오.
   5. 1% PBS BSA 995μL에 1차 항체 5μL를 첨가하여 1:200으로 희석된 오클루딘 1차 항체 용액을 준비합니다. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
   6. 1% BSA-PBS 999μL에 2차 항체 1μL를 추가하여 1:1,000으로 희석된 2차 항체 용액을 준비합니다. 용액을 빛으로부터 보호하여 얼음 위에 보관하십시오.
   7. PBS 990μL에 1mg/mL의 TRITC 10μL를 추가하여 10μg/mL의 팔로이딘 TRITC 용액을 준비합니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
2. 면역염색
   참고: 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양은 흔들리는 플랫폼(30rpm)에서 천천히 교반하면서 RT에서 수행됩니다. 면역염색은 세포 배양 삽입물에서 직접 수행된다.
   1. 기초 및 정점 매체를 제거하십시오. 화학 후드 아래에 플레이트를 놓습니다.
   2. 단층을 RT에서 200μL의 PBS로 2회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
   3. RT에서 200μL의 4% PFA로 세포 단층을 고정하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   4. 단층을 RT에서 200μL의 PBS로 2회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
      참고: 고정 및 세척 단계 후, 단분자층은 PBS에서 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
   5. PBS를 제거하고, 0.2% 트리톤 X100-PBS의 200 μL로 투과화하고, 20분 동안 배양한다.
   6. 단층을 RT에서 200μL의 PBS로 2회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
   7. 1% BSA-PBS에 1차 항체 용액 200μL를 첨가하고 흔들리는 플랫폼에서 천천히 교반하면서 4°C에서 밤새 배양합니다. 1차 항체 없이 1% BSA-PBS만을 첨가하여 음성 대조군 웰을 포함시킨다.
   8. RT에서 200 μL의 PBS로 단층을 3회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
   9. 200 μL의 2차 항체를 1% BSA-PBS에 첨가하고 빛으로부터 보호되는 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
   10. RT에서 200 μL의 PBS로 단층을 3회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
   11. 10μg/mL의 팔로이딘 TRITC 200μL를 추가하고 10분 동안 배양합니다.
   12. 단층을 RT에서 200μL의 PBS로 2회 세척하고 5분 동안 배양합니다.
   13. PBS를 제거하고 메스로 멤브레인을 자릅니다.
   14. 한 쌍의 핀셋으로 멤브레인을 회수하고 정점 면이 위를 향하도록 현미경 슬라이드에 놓습니다.
   15. DAPI가 보충된 마운팅 배지 15μL를 1:1,000으로 멤브레인에 직접 추가합니다. 커버슬립을 놓고 밀봉합니다.
   16. 이미징이 이루어질 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.

결과

위에서 설명한 프로토콜에 따라 돼지 장에서 상피 자와를 채취하여 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 냉동 보존합니다(그림 1 및 그림 2A). 해동 후, crypt 줄기 세포는 ECM에 파종됩니다 (그림 2B). crypt 구조는 일반적으로 ECM에서 crypt 구조의 붕괴로 인해 이 단계 후에 손실됩니다. 오가노이드는 3-4일 이내에 관찰할 수 있으며, 그 후 빠르게 성장하고 발아 구조가 발달합니다(그림 2B). 우리는 시도의 >80%에서 냉동 크립트를 해동한 후 오가노이드를 성공적으로 얻었습니다. 해동 후 약 10일 후(오가노이드의 성장률에 따라) 배양을 확장하기 위해 오가노이드의 계대가 수행됩니다(그림 3). 오가노이드는 분열 후 더 빨리 성장하며 일부 낭성 오가노이드와 대부분의 신진 오가노이드와 함께 다양한 형태를 나타냅니다. 배양의 최적 유지를 위해 계대배양에 사용되는 오가노이드는 성숙한 오가노이드에서 관찰되는 바와 같이 깨끗하고 비어 있는 내강과 잘 정의된 가장자리(예: 녹색 화살표로 표시)를 나타내야 하며, 내강에 검은색 파편(빨간색 화살표로 표시)이 없어야 합니다(그림 3). 우리는 흑혈구 파편이 통과 후 6일째 되는 날에 축적되기 시작한다는 것을 발견했습니다. 따라서 계대배양 후 4-5일에 오가노이드를 분할하거나 동결하는 것이 좋습니다.

오가노이드의 성숙 단계는 또한 세포 단층을 얻는 데 중요한 포인트입니다. 성숙도가 높은 오가노이드(루멘에 흑색 세포 파편이 있는 것으로 표시됨)는 단층을 시드하는 데 최적이 아닙니다. 우리는 일반적으로 2D 배양을 위한 세포를 수집하기 위해 통과 후 4일 후에 3D 오가노이드를 해리합니다. ECM의 50μL 돔당 3,000개 세포에서 배양된 약 1-3개의 3D 오가노이드 웰은 2.5 x 10⁵ 세포로 하나의 배양 삽입물을 파종하는 데 필요합니다. 세포는 부착되어 1일 이내에 완전히 합류하는 단분자층을 형성하며(그림 4A), 이는 약 700 Ω·^cm2 의 높은 TEER로 확인됩니다(그림 4B). 그러나 세포 가장자리는 이 초기 시점에서 명시야 현미경으로 시각화하기 어려운데, 이는 아마도 낮은 분화 수준 때문일 것입니다. TEER은 3일 동안 높은 상태를 유지합니다(그림 4B).

액틴 염색은 3D 오가노이드에서 상피 세포의 정점 쪽이 내강을 향하고 있음을 나타냅니다(그림 5A). 배양 삽입물에 파종된 오가노이드 세포는 상피 세포의 합류 단층을 형성하며, 정점 쪽은 상부 구획을 향합니다(그림 4B, C). Occludin 염색은 3D 오가노이드 및 세포 단층에서 상피 세포의 정점 쪽에 밀착 접합부의 존재를 보여줍니다(그림 5A-C).

그림 1: 3D 오가노이드 및 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 배양하는 데 사용되는 방법의 개략도. 상피 선와(Epithelial crypt)는 새끼 돼지 장에서 분리됩니다. 이러한 크립트는 i) 3D 오가노이드를 배양하는 데 즉시 사용하거나 ii) 액체 질소의 바이오뱅크에 냉동 및 보관할 수 있습니다. 냉동보존된 크립트는 해동하여 3D 오가노이드 배양에 사용할 수 있습니다. 3D 오가노이드 배양은 연속적인 분할로 유지되거나 바이오뱅크에 냉동 및 저장될 수 있습니다. 세포 단분자층은 3D 오가노이드 배양에서 얻어 세포의 정점 측면에 접근하고 상피 장벽 기능을 연구할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 냉동보존된 상피선와에서 돼지 장 3D 오가노이드 배양. (A) 갓 분리된 공장 지하실의 대표적인 현미경 이미지. (B) 공장 선와를 해동한 후 얻은 3D 오가노이드의 대표적인 현미경 이미지. 오가노이드는 48웰 플레이트의 ECM 돔 25μL에서 배양되었습니다. 그림은 파종 후 4일, 7일, 8일, 9일 및 10일째의 3D 오가노이드 이미지를 보여줍니다. 스케일 바는 500μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 첫 번째 계대 후 냉동보존된 상피 선와에서 유래한 돼지 장 3D 오가노이드의 형태. 4일차부터 7일차까지 첫 번째 계대 후 냉동보존된 공장음와에서 유래한 오가노이드의 발달을 보여주는 대표적인 현미경 이미지. 녹색 화살표는 단층의 통과 또는 파종에 적합한 투명한 오가노이드를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 단층을 분할하거나 파종하는 데 적합하지 않은 성숙한 오가노이드를 나타냅니다. 따라서 이 형태가 발현되기 전에 우물을 사용해야 합니다. 스케일 바는 500μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 돼지 장내 3D 오가노이드에서 유래한 세포 단층의 특성 . (A) 3일 동안의 단층 형태의 대표적인 현미경 이미지. 공장 오가노이드 세포를 2.5 x 10⁵ 세포에서 50 ng/mL의 콜라겐 IV로 코팅된 0.33 cm² 세포 배양 삽입물에 시딩했습니다. 눈금 막대는 500μm를 나타냅니다. (B) 3일 동안 오가노이드 세포 단층의 경상피 전기 저항(TEER). 선으로 연결된 점들은 서로 다른 시간에 같은 우물에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 3D 또는 2D로 배양된 돼지 공장 오가노이드의 이미징. (A) 분할 5일 후 3D 오가노이드 및 파종 3일 후 (B,C) 오가노이드 세포 단층의 공초점 현미경 이미징(B: XZ 섹션; C: XY 섹션). DNA(청색)는 DAPI로 염색하였다. 액틴(적색)은 팔로이딘으로 염색하였다. Occludin(녹색)은 다클론 항체로 염색되었습니다. 흰색 화살표는 밀착 접합부에 국한된 폐색도를 나타냅니다. 스케일 바는 20μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 3D 오가노이드의 장기 보관 및 후속 배양을 위해 새끼 돼지 장에서 상피 선와를 냉동 보존하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 DMSO, FBS, Y27632 ROCK 억제제, DMEM 및 항생제를 포함하는 동결 용액을 사용합니다. 돼지를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 유사한 동결 용액에 냉동 보존된 지하실에서 오가노이드를 얻었지만 ROCK 억제제는 없었습니다¹⁵. Y27632 ROCK 억제제는 해동 후 상피 선와 세포가 해리되어 세포 사멸('anoikis')을 유발할 수 있기 때문에 세포자멸사를 방지하고 줄기 세포 풀을 유지하기 위해 포함되었습니다('anoikis^')27,28. 흥미롭게도, 말 엔테로이드는 DMEM 및 DMSO¹⁶만을 함유하는 배양 배지에서 냉동된 상피 선와로부터 얻어졌다; 이 간단한 방법은 아직 돼지 상피 선와에 대해 테스트되지 않았습니다. 상피 궤도 대신 냉동 조직 또는 생검에서 인간 및 돼지 오가노이드를 성장시키는 다른 방법이 발표되었습니다 ^4,17. 이 방법의 장점은 시간과 실험실 장비가 필요한 지하실 분리 절차를 수행하지 않고 장 조직을 직접 냉동 보존 할 수 있다는 것입니다. 이것은 조직을 실험실에서 멀리 떨어진 곳에서 수집해야 할 때 편리할 수 있습니다. 그러나, 도축 직후에 선와를 분리 할 때, 장의 큰 부분은 매우 많은 수의 선와를 얻기 위해 처리 될 수 있으며, 이는 작은 냉동 조직 조각에서 시작할 때가 아닙니다. 상피 선와가 해동된 후, 파종 후 3-4일째부터 오가노이드를 관찰하고 10일 후에 분할하였다. 이는 신선한 상피 선와에서 배양을 시작할 때보다 성장 속도가 느리며, 이에 대해 오가노이드는 파종 후 1일째부터 얻었으며 일반적으로 약 5일째에 분할될 수 있습니다¹¹. Khalil et al. 또한 냉동 지하실에서 시작할 때 돼지 엔테로이드의 성장이 지연된다고 보고했다¹⁵, 이는 줄기 세포가 증식 능력을 회복하는 데 시간이 필요할 수 있음을 시사한다. 우리는 또한 신선한 선와에 비해 냉동 선와에서 시작할 때 더 적은 수의 오가노이드를 얻었는데, 이는 냉동 과정에서 줄기 세포의 죽음으로 인한 것일 수 있습니다. 지하실 해동의 일부 시도(<20%)에서 우리는 아마도 차선의 냉동 보존 절차(예: 아마도 1시간 이상의 선와를 분리한 후 지연된 동결)로 인해 냉동 지하실에서 오가노이드를 얻지 못했습니다. 따라서 세어 볼 때까지 지하실을 얼음 위에 보관하고 가능한 한 빨리 얼리는 것이 좋습니다.

3D 오가노이드의 경우 인간을 위해 제조된 상업용 오가노이드 배양 배지를 사용하기로 결정했습니다. 실제로 이전 보고서에 따르면 돼지 장 오가노이드는 이 배지 8,11,14,19,25,26,29,30으로 효율적으로 성장합니다. 이 배양 배지는 즉시 사용할 수 있고 배치 내에서 표준화된 농도의 성장 인자를 갖는 것이 중요합니다. 그러나, 이 배양 배지는 비용이 많이 들고, 그 조성은 개시되지 않았으며, 따라서 그 조성을 조절하는 것은 불가능하다. 대조적으로, 다른 연구에서는 약리학적 억제제, 재조합 성장 인자 및/또는 조건 배지를 포함하는 맞춤형 배지에서 돼지 장 오가노이드를 배양했습니다 5,6,7,21. 이 방법은 매우 유연하고 저렴하지만 컨디셔닝 매질을 생산하는 데 시간이 많이 걸리고 컨디셔닝 매질에서 성장 인자 농도의 잠재적 변동성으로 인해 재현성이 부족할 수 있습니다. 따라서, 컨디셔닝 배지의 각 배치의 품질은 오가노이드 성장 또는 마커 유전자 발현을 측정하여 검증되어야 한다³¹.

한 연구에 따르면 여기에 사용된 것과 동일한 상업용 오가노이드 배양 배지에서 배양된 돼지 공장 오가노이드는 재조합 성장 인자 및/또는 컨디셔닝 배지를 함유한 배지로 배양한 엔테로이드에 비해 더 빨리 성장하고 덜 분화된 것으로 나타났습니다²³. 높은 증식 상태는 3D 오가노이드의 배양을 용이하게 하지만 장내 생리학적 특성을 더 잘 나타내기 위해 분화 유도가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 3D 오가노이드의 통과를 위해 세포가 계수를 위해 완전히 해리되어 ECM에 시딩된 세포의 수를 제어할 수 있습니다. 이것은 오가노이드의 표현형의 재현성을 증가시키며, 이는 밀도에 크게 영향을 받습니다. 또한, 세포 수를 세면 배양 일정을 조정해야 하는 너무 낮거나 과밀한 배양을 얻는 것을 방지할 수 있습니다. 대부분의 다른 연구에서는 단일 세포에 완전히 해리되지 않은 오가노이드 단편을 준비하고 계대 배양을 위해 희석 비율을 사용했습니다. 이 방법은 더 간단하지만 배양의 오가노이드 밀도에 따라 변동성을 유발할 수 있습니다.

단층 배양의 경우, 오가노이드 세포는 ECM의 얇은 층으로 미리 코팅된 배양 삽입물에 시딩되어 세포의 부착을 허용하지만 3D에서 오가노이드의 성장을 방지합니다. 이 프로토콜은 이전에 돼지²³에서 설명한 바와 같이 콜라겐 IV형을 ECM 단백질로 사용했습니다. 돼지 오가노이드 단층을 사용한 다른 연구에서는 3D 오가노이드 6,8,9,21,25,30을 배양하기 위해 여기에 사용된 것과 동일한 종양 유래 ECM을 사용했습니다. 콜라겐 사용의 장점은 종양 유래 ECM의 경우와 달리 완전히 정의된 조성으로 단백질 농도를 표준화할 수 있다는 것입니다. 세포 단층 배양의 성공을 위한 중요한 단계는 전구체 3D 오가노이드의 시각적 외관에 주의를 기울이는 것인데, 이는 가장자리가 잘 정의되어 있고 검은색 파편이 없는 빈 루멘이 있어야 합니다. 실제로, 성숙도가 높고 증식률이 낮은 오가노이드는 2D 배양을 위한 적절한 세포 공급원이 아닙니다. 따라서 3D 오가노이드가 단일 세포로 해리되는 시기는 이 단계의 성공에 매우 중요합니다.

단일 세포에서 2D 단층을 배양하면 시딩된 세포 수를 표준화할 수 있으며, 이는 다른 방법에서 수행되는 것처럼 오가노이드 단편에서 시작할 때 더 어렵습니다. 우리는 cm2 당 7.6 x 10 5 세포를 시딩했는데, 이는 cm2 당 0.25 x 10 5 세포에서^cm2 당 1.78 x 10 ⁵ 세포에 이르는 낮은 세포 밀도를 사용한 돼지에서 대부분의 다른 연구^21,22,23에 비해 높습니다. 많은 수의 오가노이드 세포가 필요하다는 것이 이 프로토콜의 한계를 구성하지만, 이를 통해 1일 후에 배양 삽입물을 완전히 덮는 융합 단층을 신속하게 얻을 수 있었습니다. 대조적으로, Vermeire et al.23은 더 낮은 밀도의 세포(^0.25 x 10 5 cells/cm²에서 0.4 x 10⁵ cells/cm²)로 4-7일 후에 합류성을 얻었습니다. 일부 연구에서는 바이러스 감염을 위해 배양 표면을 완전히 덮지 않은 돼지 오가노이드 세포 단층을 사용하기도^{했습니다 8,30}. 이러한 조건에서 상피 세포의 정점 측면은 치료를 위해 접근할 수 있지만 영양소 흡수 또는 상피 투과성을 연구하는 것이 목적인 경우 완전히 합류하는 단층이 필요합니다.

오가노이드 세포 단층의 경우, 소 엔테로이드 유래 단층(zovine enteroid-derived monolayers)에 대한 최근 연구를 기반으로 20% FBS가 보충된 상업용 오가노이드 배양 배지가 사용되었다³². 우리의 테스트에서, 20 % FBS로 보충은 아마도 높은 성장 인자 요구 사항으로 인해 완전히 합류 단층을 얻기 위해 필요했습니다. 반대로, 동일한 상업적 매체를 사용하는 다른 연구에서는 추가 FBS ^8,25,30 없이 완전한 합류도에 도달하지 못한 단층을 확립했습니다. 다른 연구에서도 돼지 오가노이드 세포 단층 배양을 위해 맞춤형 배지에 20% FBS 보충제를 사용했습니다^21,22. 우리의 실험에서 TEER은 파종 후 1일(약 700 Ω·cm2)에 높고 3일째(약 1,500 Ω·^cm2; 이것은 오클루딘의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 단단한 접합부의 형성과 일치합니다. Van der Hee et al. 공장 오가노이드 세포 단층²¹에 대해 72시간 동안 유사한 TEER 값을 얻었다. 그들은 또한 단층이 매일 배지 교체로 12-15일까지 유지될 수 있음을 입증했습니다. 대조적으로, 다른 연구에서는 돼지 오가노이드 세포 단층 ^6,22에 대해 훨씬 낮은 TEER 값(약 ²⁰⁰ Ω·^cm2)을 보고했습니다. 연구 간의 이러한 차이는 연구 된 장 세그먼트 또는 상피 분화에 영향을 미치는 데 사용되는 매체와 관련이있을 수 있습니다.

결론적으로, 냉동 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 성장시키기 위한 위의 프로토콜은 배양 작업의 조직을 용이하게 합니다. 살아있는 동물에서 신선한 조직을 얻을 필요가 없습니다. 또한 돼지 오가노이드에서 유래한 완전 융합 세포 단층을 3일 이내에 확립하는 방법도 설명합니다. 따라서 우리의 프로토콜은 수의학 또는 생물 의학 연구를 위해 돼지 장 상피를 연구하는 과학자들에게 유용한 자료가 될 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Store at room temperature.
15 mL conical tube	Sarstedt	62.554.502
24-well cell culture plate	Corning	003526
48-well cell culture plate	Corning	003548
50 mL polypropylene conical tube	Falcon	352070
Bovine Serum Albumine (BSA)	Euromedex	A6003	Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R	Hettich	1406
Collagene type IV from human placenta	Sigma	C5533	Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container	Corning	432003	Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm	VWR	630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL	Clear line	390706	Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI	Invitrogen	D1306	Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT)	Merck	10197777001	Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	31966047	Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25-950-CQC	Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide	VWR	631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22363549	Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator	VWR	97025-564	Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010015	Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific	12605-010	Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008	Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell Technology	6010	Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells	Corning	353095
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectashield	H1250	Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	71-1500	Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32%	Electron microscopy science	15714	Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC	Sigma	P1951	Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632)	ATCC	ACS-3030	Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL	Clear line	062646CL	Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL	Corning	4488
Tissue Culture Dish	TPP	93100
Triton X100	Sigma	8787	Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282	Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip	Integra	159000	Used to remove the medium of organoid wells.