实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征

摘要

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪测量小鼠和人中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的逐步方案。

摘要

中性粒细胞是人类的第一道防线，也是最丰富的白细胞。这些效应细胞执行吞噬作用和氧化爆发等功能，并产生中性粒细胞细胞外陷阱（NET）用于微生物清除。对中性粒细胞代谢活动的新见解挑战了它们主要依赖于糖酵解的早期概念。代谢活动的精确测量可以揭示中性粒细胞的不同代谢需求，包括生理条件和疾病状态下的三羧酸（TCA）循环（也称为克雷布斯循环），氧化磷酸化（OXPHOS），磷酸戊糖途径（PPP）和脂肪酸氧化（FAO）。本文描述了在代谢细胞外通量分析仪上进行代谢通量分析，测量小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血源性中性粒细胞和中性粒细胞样HL60细胞系的耗氧率（OCR）作为线粒体呼吸指标的分步方案和先决条件。该方法可用于量化中性粒细胞在正常和疾病条件下的线粒体功能。

引言

线粒体在细胞生物能量学中起主要作用，其通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。除此之外，线粒体的作用延伸到活性氧的产生和解毒，细胞质和线粒体基质钙调节，细胞合成，分解代谢^{以及细胞内}代谢物的运输1。线粒体呼吸在所有细胞中都是必不可少的，因为它们的功能障碍会导致代谢问题²，包括心血管疾病³ 和多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性⁴，帕金森氏症和阿尔茨海默氏症⁵，以及Charcot-Marie-Tooth疾病2 A（CMT2A）⁶。

对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，线粒体⁷相对较少，并且由于线粒体呼吸^{速率非常低，}它们严重依赖糖酵解来产生能量8。然而，线粒体对中性粒细胞功能至关重要，例如趋化性⁹和细胞凋亡^10,11,12。之前的一项研究揭示了具有高膜电位的人中性粒体中性粒体网络。线粒体膜电位丢失是中性粒细胞凋亡的早期指标¹⁰。用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯基腙（CCCP）处理显示出对趋化性的显着抑制，以及线粒体形态的变化^9,10。

虽然中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过推动嘌呤能信号传导的第一阶段来提供启动中性粒细胞激活的 ATP，从而促进 Ca²⁺ 信号传导，放大线粒体 ATP 的产生，并启动中性粒细胞功能反应¹³。线粒体呼吸链功能障碍导致有毒活性氧（ROS）的过量产生并导致致病性损害^14,15,16。NETosis是形成中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的过程，是中性粒细胞的关键特性，可帮助它们对抗病原体¹⁷，并导致许多病理状况，包括癌症，血栓形成和自身免疫性疾病¹⁸。线粒体来源的 ROS 有助于 NETosis¹⁹，线粒体 DNA 可以是^{NETs 18} 的组成部分，线粒体稳态改变会损害 NETosis 20,21,22,23,24。此外，在正常分化或成熟期间，中性粒细胞代谢重编程通过限制糖酵解活性而被逆转，并且它们参与线粒体呼吸并动员细胞内脂质^25,26。

代谢细胞外通量分析仪可以连续监测和量化活细胞线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪利用一个 96 孔板格式的传感器盒和两个荧光团来量化氧 （O₂） 浓度和 pH 值变化。在测定过程中，传感器盒位于细胞单层上方，并形成~200nm高的微室。分析仪中的光纤束用于激发荧光团并检测荧光强度变化。自动计算 O₂ 浓度和 pH 值的实时变化，并显示为耗氧速率 （OCR） 和细胞外酸化速率 （ECAR）。传感器盒上有四个端口，允许在测定测量期间将多达四种化合物加载到每个孔中。该协议侧重于使用代谢细胞外通量分析仪量化小鼠和人中性粒细胞的线粒体呼吸，以及中性粒细胞样HL60细胞。

研究方案

肝素化全血样本是在获得知情同意后从健康人类捐赠者那里获得的，经康涅狄格大学卫生机构审查委员会根据赫尔辛基宣言批准。所有动物实验都遵循康涅狄格大学卫生机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针，并根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中概述的标准，获得了康涅狄格大学健康IACUC对啮齿动物的使用批准。本研究使用6周龄的雄性C57BL / 6小鼠。

1.用于代谢细胞外通量测定的96孔板的制备

1. 传感器盒封装在专门设计的 96 孔板顶部，用于代谢细胞外通量测定。小心地提起墨盒水合墨盒，并将 200 μL/孔的校准培养基放入下层板的每个孔中。将滤芯放在带有校准剂的板上，置于非CO₂，加湿，37°C培养箱中过夜以水合。
2. 根据细胞类型，为培养板使用特定的涂层以确保细胞粘附。对于人中性粒细胞 - 未分化和分化的HL60细胞 - 用含有50μL5μg/ mL纯化的小鼠抗人CD18抗体（克隆TS1 / 18）的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）在4°C下涂覆96孔板过夜。对于小鼠中性粒细胞，在室温 （RT） 下在 pH 8.0 的 0.1 M NaHCO₃ 中用 25 μL 22.4 μg/mL Cell Tak 涂覆 96 孔板 20 分钟。
3. 用 200 μL 无菌 PBS 清洗板两次。
4. 将完全培养基添加到细胞培养板（无细胞）的角孔（A1、A12、H1 和 H12）中，以便在接种时在细胞培养板中进行背景校正。
   注意:涂层和校准过程中的蒸发可能会影响校准介质的体积和归一化。使用带有无菌水润湿组织的托盘或腔室，并将带有校准剂的板放在其上方以防止蒸发。

2. 细胞的制备和接种

1. 检测培养基的制备
   1. 通过将 1 mM 丙酮酸、10 mM 葡萄糖和 2 mM 谷氨酰胺添加到 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中来制备测定培养基。
2. 从骨髓中分离小鼠中性粒细胞
   1. 根据制造商的说明，使用小鼠中性粒细胞富集试剂盒从骨髓中分离小鼠中性粒细胞。
   2. 通过腹膜内（ip）注射氯胺酮（125mg / kg）和甲苯噻嗪（12.5mg / kg）麻醉小鼠，然后通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
   3. 收获股骨和胫骨，如前所述²⁷.简而言之，切开皮肤以露出带有肌肉的腿。切开髋关节，将腿从身体上移开。然后，移除肌肉以收集股骨和胫骨。
   4. 切开股骨和胫骨的较小末端。按住切割端，将它们放入底部有两个25 G注射器针孔的0.5 mL离心管中，然后将0.5 mL管放入1.5 mL离心管中（图1A）。将 50 μL PBS 加入 0.5 mL 管中，以防止骨髓细胞干燥。
   5. 在室温下以 5,900 × g 离心 15 秒，以收集 1.5 mL 管底部的骨髓。用 1 mL DMEM 重悬骨髓细胞。从试剂盒中加入 50 μL 大鼠血清，通过移液轻轻混合，然后将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
   6. 从小鼠中性粒细胞富集试剂盒中加入 50 μL 富集鸡尾酒，并在室温下孵育 15 分钟。 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
   7. 用 1 mL DMEM 重悬细胞，从试剂盒中加入 50 μL 生物素选择鸡尾酒，通过移液轻轻混合，并在室温下孵育 15 分钟。
   8. 从试剂盒中加入 150 μL 涡旋磁性颗粒，通过移液轻轻混合，并在室温下孵育 10 分钟。
   9. 加入~1.3 mL DMEM，通过移液轻轻混合，将管放入磁铁中 3 分钟，通过将原始管与磁铁一起倒置，将含有纯化小鼠中性粒细胞的上清液转移到新的 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
   10. 在室温下以300× g 离心5分钟。通过真空抽吸除去上清液后，用1mL测定培养基重悬细胞。
   11. 使用血细胞计数器手动计数细胞。
   12. 通过加入测定培养基将细胞密度调节至1.1×10⁶ 细胞/ mL，将每孔180μL小鼠中性粒细胞悬液（2×10⁵ 细胞）接种到制备的96孔板中（步骤1.2-1.4），并将板在室温下以300 ×g 离心3分钟而不制动以确保细胞在板底部的适当粘附。
   13. 将板在非CO₂，加湿的37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
       注意:中性粒细胞的纯度对于测定至关重要，因为它是潜在的偏差。通过该方案，小鼠中性粒细胞分离的纯度为69.9%-88.7%。还有其他方法可以从小鼠骨髓中分离中性粒细胞，例如密度梯度离心²⁸。还有来自其他供应商的替代中性粒细胞分离试剂盒，基于负磁性选择，使用针对中性粒细胞上未表达的抗原的单克隆抗体。
3. 从外周血中分离人中性粒细胞
   1. 将 8 mL 多糖溶液加入 15 mL 离心管中，然后在多糖溶液上叠加 4 mL 外周血，不混合。
   2. 在20°C下以550× g 离心30分钟。使转子在 1 时减速。
      注意:中性粒细胞分离时间可能因供体而异。它至少需要 30 分钟，如果中性粒细胞分离不成功，可能需要额外的 10-20 分钟。
   3. 观察离心后血浆/血小板和单核细胞的分离，如图 1B所示。使用 1 mL 移液管小心去除顶部（血浆和血小板）和上部混浊带（单核细胞）上的上部黄色液体，而不会干扰下部混浊带（中性粒细胞）。
   4. 将下部浑浊带和下方~3-4 mL透明液体收集到含有10 mL PBS的新15 mL离心管中。
   5. 在20°C下以400 ×g 离心10分钟，并通过真空抽吸除去上清液。
   6. 用5mL PBS重悬细胞，并在20°C下以300 ×g 离心5分钟。
   7. 除去上清液后，用1mL测定培养基重悬细胞。
   8. 使用血细胞计数器手动计数细胞。
      注意:由于血液中的红细胞没有任何线粒体，因此红细胞污染不会影响线粒体应激试验测定并阻止中性粒细胞活化/启动^29,30。在细胞计数过程中需要裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 μL 细胞悬液加入 891 μL 去离子水中 10-30 秒以裂解红细胞，然后加入 99 μL 10x PBS 以平衡渗透压，避免中性粒细胞裂解。
   9. 通过加入测定培养基将细胞密度调节至 2.2 × 10⁶ 个细胞/mL，将每孔接种 180 μL 人中性粒细胞 （~4 × 10⁵） 到制备的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心板 3 分钟，无需制动，以确保细胞在板底部正确粘附。
   10. 将板在非CO₂，加湿，37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
       注意:中性粒细胞的纯度对于测定至关重要，因为它是潜在的偏倚。人中性粒细胞分离纯度为86.6%-96.8%。还有其他密度梯度离心方法可用于从人血液中分离中性粒细胞，包括Percoll分离以及Ficoll分离和葡聚糖沉降的组合³¹。
4. HL60细胞培养和中性粒细胞定向分化
   1. 在罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI）-1640 培养基中维持含有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B 的培养基中的 HL60 细胞在 37 °C 和 5% CO₂。
   2. 对于中性粒细胞定向分化，将 HL60 细胞（悬浮细胞）保持在 T25 烧瓶中的密度为 1 × 10 5 个细胞/mL 在含有 10% FBS、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B 和 1.3% 二甲基亚砜 （DMSO） 的 RPMI-1640 培养基中，在 37 °C 和 5% CO₂ 下维持 6 天。
   3. 在测定当天，使用血细胞计数器手动计数细胞，在室温下以300× g 离心分化或未分化的HL60细胞5分钟，用DMEM洗涤一次，并用测定培养基重悬细胞以获得1.39×10⁶ 细胞/ mL的细胞密度。
   4. 将每孔 180 μL 分化或未分化的 HL60 细胞（~2.5 × 10⁵）接种到制备的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心板 3 分钟而不制动以确保细胞在板底部的适当粘附。
   5. 将板在非CO₂，加湿的37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
      注意:在下一步之前，使用显微镜确认细胞的完全粘附。

图1:骨髓细胞和中性粒细胞分离示意图。 （A）从小鼠身上收获骨髓细胞和（B）从人类血液中分离中性粒细胞。 请点击此处查看此图的大图。

细胞类型	每孔细胞数	化合物/试剂	工作溶液浓度	端口进样量	井中的最终浓度
小鼠中性粒细胞	2 ×10 5	寡霉素	25微米	20 微升	2.5微米
		苜蓿属	7.5微米	17.6 微升	0.61微米
		鱼藤酮抗霉素A混合物	10 微米	24 微升	1 微米
人中性粒细胞	4 ×10 5	寡霉素	10 微米	20 微升	1 微米
		苜蓿属	12.5微米	22 微升	1.25微米
		鱼藤酮抗霉素A混合物	10 微米	24 微升	1 微米
未分化或分化的HL60细胞	2.5 × 105	寡霉素	25微米	20 微升	2.5微米
		苜蓿属	15微米	22 微升	1.5微米
		鱼藤酮抗霉素A混合物	10 微米	24 微升	1 微米

表1:线粒体应激试验的细胞数和试剂浓度。

3. 在线粒体压力测试试剂盒中制备化合物

1. 打开线粒体压力测试试剂盒并准备试剂。
   注意:用于小鼠中性粒细胞，人中性粒细胞和HL60细胞的不同工作溶液浓度，注入孔中的体积以及孔中的最终浓度用于小鼠中性粒细胞，人中性粒细胞和HL60细胞。
   1. 通过用 630 μL 测定培养基重构寡霉素来制备寡霉素储备溶液，以获得 100 μM 储备溶液。
      注意:建议在同一天使用储备溶液。
      1. 通过将 630 μL 储备溶液与 1,890 μL 测定培养基混合以获得 25 μM 工作溶液，制备用于小鼠中性粒细胞和 HL60 细胞测定的寡霉素工作溶液。
      2. 通过将 300 μL 储备溶液与 2,700 μL 测定培养基混合以获得 10 μM 工作溶液，制备用于人中性粒细胞测定的寡霉素工作溶液。
         注意:寡霉素与 Fo/F1 ATP 酶（ATP 合酶）的 Fo 基板亚基的结合可防止质子重新进入线粒体并抑制 ATP 合成³²。这大大减少了通过电子传输链和OCR的电子流量。然而，由于质子泄漏穿过线粒体内膜³³，电子流不会完全停止。
   2. 通过用 720 μL 测定培养基重构 FCCP 来制备 FCCP 储备溶液，以获得 100 μM 储备溶液。
      1. 通过将 300 μL 储备溶液与 3,700 μL 测定培养基混合以获得 7.5 μM 工作溶液，制备小鼠中性粒细胞测定的工作溶液。
      2. 通过将 375 μL 储备溶液与 2,625 μL 测定培养基混合以获得 12.5 μM 工作溶液，制备人中性粒细胞测定的工作溶液。
      3. 通过将 720 μL 储备溶液与 4,080 μL 测定培养基混合以获得 15 μM 工作溶液，制备用于 HL60 细胞测定的工作溶液。
         注意:FCCP的添加揭示了线粒体使用OXPHOS的最大容量。它是一种脂溶性弱酸，可渗透到线粒体，导致跨膜电位的消散。将质子梯度放电穿过线粒体内膜并从Fo / F1 ATP合酶转移质子通量导致线粒体解偶联。这种解偶联效应突然增加了线粒体的耗氧量，以保持质子梯度³⁴。
   3. 通过将鱼藤酮/抗霉素 A 混合物与 540 μL 测定培养基重新配制来制备鱼藤酮/抗霉素 A 储备溶液，以获得 50 μM 储备溶液。
      1. 通过将 540 μL 储备溶液与 2,160 μL 测定培养基混合以获得 10 μM 工作溶液，制备鱼藤酮/抗霉素 适用于所有测定的工作溶液。
         注意:鱼藤酮通过抑制从复合物I中的铁硫中心到泛醌的电子转移来阻断复合物I，而抗霉素A阻断电子传递链的复合物III，导致ATP³⁵的有限合成阻断OXPHOS。因此，这揭示了非线粒体呼吸^36,37。
2. 用试剂装入试剂盒;将制备好的寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A 混合物分别加载到药筒中的 A、B 和 C 端口进行注射（图 2）。使用随小柱一起提供的模板插件，以便将试剂加载到端口。用 20 μL 测定培养基填充未使用的端口。
   1. 对于小鼠中性粒细胞测定，将20μL寡霉素（25μM;96孔板的每个孔开始时有180μL测定培养基，因此终浓度为2.5μM）加载到A端口中。将 17.6 μL FCCP（7.5 μM;终浓度:~0.61 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度:~1 μM）加载到 C 端口中。
   2. 对于人中性粒细胞测定，将 20 μL 寡霉素（10 μM;96 孔板的每个孔开始时有 180 μL 测定培养基，因此最终浓度为 1 μM）加载到 A 端口中。将 22 μL FCCP（12.5 μM;终浓度:~1.25 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度:~1 μM）加载到 C 端口中。
   3. 对于HL60和dHL60细胞测定，将20μL寡霉素（25μM;96孔板的每个孔开始时有180μL测定培养基，因此最终浓度为2.5μM）加载到A端口中。将 22 μL FCCP（15 μM;终浓度:~1.5 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度:~1 μM）加载到 C 端口中。
      注意:在端口中吸取药物溶液，不要接触端口底部。装载后不要敲击板以避免泄漏，因为液体被毛细管力固定。培养板的背景孔和传感器盒上的端口装有检测培养基或与样品孔中相同的试剂加载端口，以使试剂对背景值的影响归一化。试剂必须添加到相应的端口，而无需将试剂盒从含有校准剂的实用板上提起，以避免任何空气滞留。如图2所示，用培养基填充所有孔的最后一个端口。

图2:线粒体应力测定试剂盒及其注射口。 该图像显示了线粒体应激测定的墨盒和显示单个药物/培养基到端口的加载的放大图像。缩写:FCCP = 羰基 氰对三氟甲氧基苯腙。 请点击此处查看此图的大图。

4. 运行线粒体应激测定

1. 打开代谢分析仪和计算机的电源，打开 Wave 软件，然后单击 加热器打开 以至少提前5小时将机器设置为37°C。达到温度后，波软件的左下角显示 就绪。
2. 在软件中打开线粒体应激测定试剂盒的模板。单击顶部菜单栏中的 组定义 。
3. 在左侧分别预先设置每个定义，例如注射策略、预处理、分析培养基和（使用的生物材料）细胞类型。
4. 单击左侧的注射策略，然后单击添加并将注射条件命名为人中性粒细胞/小鼠中性粒细胞/HL60。通过单击每个端口选择端口A-D，然后单击添加化合物，然后输入具有相应浓度的寡霉素/FCCP/鱼藤酮抗霉素A（表1）。
5. 单击左侧的预处理，然后单击添加并分别将它们命名为 CD18 和 Cell Tak。单击左侧使用的生物材料，然后单击添加并将它们命名为具有接种密度的人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞和 HL60/dHL60。
6. 通过单击添加组（例如，用于人中性粒细胞测定）并单击其基础定义（例如，表1中的注射策略-人中性粒细胞，预处理为CD18，细胞类型为人中性粒细胞）来定义组。
7. 单击顶部菜单中的板图以观察所有组，左侧是定义，右侧是 板图 。拖放以将每个孔添加到组中，同时将四个角孔保留为 背景 （默认）。
8. 通过单击顶部菜单中的协议来设置方案，并通过将混合时间为 3 分钟、休息为 0 分钟和测量设置为 7 分钟来定义基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物的三个周期。
9. 转到"运行 分析 "页面，提供项目摘要信息以供参考，然后单击" 开始运行"。
10. 给出保存文件的位置，以便在测定完成后保存所有结果。
11. 自动上样测定后，等待托盘打开，将传感器盒和板放入 200 μL 校准品（步骤 1.1）。将墨盒条形码方向朝右设置。通过单击" 我准备好了"运行校准，大约需要 20 分钟。
12. 校准后，单击打开 托盘。用细胞接种板替换板，然后单击 称重传感器板 以继续测定。
13. 完成测定后，数据将自动保存。单击查看 结果 并将其导出为电子表格或其他分析软件文件。
14. 绘制和分析数据（图 3 和 图 4）。
15. 计算呼吸参数，包括基础线粒体呼吸、质子泄漏相关呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸（图 4A）38,39,40,41。
    1. 通过在注射寡霉素之前从OCR中加入鱼藤酮/抗霉素A混合物后测量的OCR值来计算基础线粒体呼吸（图4A，a）。
    2. 通过从寡霉素注射后测量的OCR值中减去鱼藤酮/抗霉素A混合物注射后的OCR值来计算质子泄漏连接的呼吸（图4A，b）。
    3. 通过计算基础线粒体呼吸和质子泄漏相关呼吸之间的差异来估计 ATP 相关的呼吸。从寡霉素注射前的第一个OCR值中减去寡霉素注射后测量的第一个OCR值（图4A，c）。
    4. 最大呼吸是细胞在添加FCCP后可以达到的最大呼吸速率。通过从FCCP注射后测量的OCR值中减去鱼藤酮/抗霉素A混合物注射后的OCR值来计算这一点（图4A，d）。
    5. 备用呼吸能力是指细胞通过 OXPHOS 满足更高能量需求的容量。通过找到最大呼吸和基础线粒体呼吸之间的差异来计算这一点（图4A，e）。
    6. 非线粒体呼吸是非线粒体来源消耗的氧气量。在加入鱼藤酮/抗霉素A混合物后测量（图4A，f）。
16. 使用学生 t检验进行统计分析，以比较未分化和分化的HL60细胞的不同呼吸参数。将 p < 0.05 视为具有统计显著性。
    注意:OCR 或 ECAR 值低于零的重复被认为是样品制备、化合物进样或测量中的错误。它们被排除在将来的分析之外。

结果

显示代表性的OCR动力学表明线粒体呼吸变化响应寡霉素，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A小鼠中性粒细胞（图3A），人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化的HL60细胞（图3C）的混合物。在所有细胞中，寡霉素处理通过抑制ATP合酶的质子通道来降低OCR值;FCCP处理通过增加电子流量和耗氧量来恢复OCR值，以维持膜电位并实现最大呼吸;和鱼藤酮/?...

讨论

使用代谢细胞外通量分析仪测量中性粒细胞线粒体呼吸的标准程序受到许多因素的限制，包括细胞数量、细胞生长和活力。在该测定中，每种化合物浓度因细胞的类型和来源而异。寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中大多以相似的浓度使用。然而，由于FCCP诱导的最大呼吸频率因不同细胞而异，因此需要仔细滴定FCCP以优化浓度⁴²。在优化期间执行 FCCP 的顺序添加也更好。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C non-CO2 incubator	Precision	Economy Model 2EG	Instrument
Biorender			Software Application
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	102416-100	Reagent
EasySep Magnet	STEMCELL	18000	Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit	STEMCELL	19762A	Reagents
Graphpad Prism 9			Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Ketamine (VetaKet)	DAILYMED	NDC 59399-114-10	Anesthetic
PBS	Cytiva	SH30256.01	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody	Biolegend	302102	Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium	Gibco	11-875-093	Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer	Agilent	XFe96	Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap	Fox Lifesciences	3052101-FLS	Instrument
Wave			Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent	103577-100	Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution	Agilent	103578-100	Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution	Agilent	103579-100	Reagent
XF DMEM medium	Agilent	103575-100	Reagent
XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Material
Xylazine (AnaSed Injection)	DAILYMED	NDC 59399-110-20	Anesthetic