Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Zusammenfassung

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Zusammenfassung

Neutrophile Granulozyten sind die erste Verteidigungslinie und die am häufigsten vorkommenden Leukozyten beim Menschen. Diese Effektorzellen führen Funktionen wie Phagozytose und oxidativen Burst aus und erzeugen extrazelluläre Fallen (NETs) für die mikrobielle Clearance. Neue Erkenntnisse über die Stoffwechselaktivitäten von Neutrophilen stellen die frühe Vorstellung, dass sie in erster Linie auf Glykolyse angewiesen sind, in Frage. Durch die präzise Messung der Stoffwechselaktivitäten können unterschiedliche Stoffwechselanforderungen von Neutrophilen aufgedeckt werden, darunter der Tricarbonsäurezyklus (TCA) (auch Krebszyklus genannt), die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), der Pentosephosphatweg (PPP) und die Fettsäureoxidation (FAO) unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen. In diesem Artikel werden ein Schritt-für-Schritt-Protokoll und die Voraussetzungen für die Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung an aus dem Knochenmark der Maus, aus menschlichem Blut gewonnenen Neutrophilen und der neutrophilenähnlichen HL60-Zelllinie unter Verwendung der metabolischen Flussanalyse auf einem metabolischen extrazellulären Flussanalysator beschrieben. Diese Methode kann zur Quantifizierung der mitochondrialen Funktionen von Neutrophilen unter normalen und Krankheitsbedingungen verwendet werden.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle in der Zellbioenergetik, die durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt. Darüber hinaus erstreckt sich die Rolle der Mitochondrien auf die Erzeugung und Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies, die Kalziumregulierung der zytoplasmatischen und mitochondrialen Matrix, die Zellsynthese, den Katabolismus und den Transport von Metaboliten innerhalb der Zelle¹. Die mitochondriale Atmung ist in allen Zellen unerlässlich, da ihre Funktionsstörung zu Stoffwechselproblemen 2 führen kann, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen³ und einer Vielzahl neurodeg....

Protokoll

Heparinisierte Vollblutproben wurden von gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gewonnen, die vom Institutional Review Board von UConn Health in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurde. Alle Tierversuche folgten den Richtlinien des UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), und die Genehmigung für die Verwendung von Nagetieren wurde von der UConn Health IACUC gemäß den Kriterien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health eingeholt. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet.

Ergebnisse

Es wird eine repräsentative OCR-Dynamik gezeigt, die auf die mitochondrialen Atmungsänderungen als Reaktion auf Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A-Mischung aus neutrophilen Granulozyten der Maus (Abbildung 3A), humanen Neutrophilen (Abbildung 3B) und undifferenzierten und differenzierten HL60-Zellen (Abbildung 3C) hinweist. In allen Zellen senkt die Behandlung mit Oligomycin den OCR-Wert, indem der Protonenkanal der ATP-Synt.......

Diskussion

Das Standardverfahren, das die mitochondriale Atmung von Neutrophilen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator misst, ist durch viele Faktoren begrenzt, darunter Zellzahl, Zellwachstum und Lebensfähigkeit. Die jeweilige Substanzkonzentration variiert je nach Art und Quelle der Zellen in diesem Assay. Oligomycin und Rotenon/Antimycin A werden bei den meisten Zelltypen meist in ähnlicher Konzentration eingesetzt. Da die FCCP-induzierte maximale Atemfrequenz jedoch zwischen verschiedenen Zellen variiert, is.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C non-CO2 incubator	Precision	Economy Model 2EG	Instrument
Biorender			Software Application
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	102416-100	Reagent
EasySep Magnet	STEMCELL	18000	Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit	STEMCELL	19762A	Reagents
Graphpad Prism 9			Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Ketamine (VetaKet)	DAILYMED	NDC 59399-114-10	Anesthetic
PBS	Cytiva	SH30256.01	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody	Biolegend	302102	Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium	Gibco	11-875-093	Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer	Agilent	XFe96	Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap	Fox Lifesciences	3052101-FLS	Instrument
Wave			Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent	103577-100	Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution	Agilent	103578-100	Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution	Agilent	103579-100	Reagent
XF DMEM medium	Agilent	103575-100	Reagent
XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Material
Xylazine (AnaSed Injection)	DAILYMED	NDC 59399-110-20	Anesthetic