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Resumo

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Resumo

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa e os leucócitos mais abundantes em humanos. Essas células efetoras desempenham funções como fagocitose e explosão oxidativa, e criam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) para depuração microbiana. Novos conhecimentos sobre as atividades metabólicas dos neutrófilos desafiam o conceito inicial de que eles dependem principalmente da glicólise. A medição precisa das atividades metabólicas pode desdobrar diferentes exigências metabólicas dos neutrófilos, incluindo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (também conhecido como ciclo de Krebs), fosforilação oxidativa (OXPHOS), via das pentoses fosfato (PPP) e oxidação de ácidos graxos (FAO) sob condições fisiológicas e em estados patológicos. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo e pré-requisitos para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador da respiração mitocondrial em neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos, neutrófilos derivados do sangue humano e a linhagem celular HL60 semelhante a neutrófilos, usando análise de fluxo metabólico em um analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método pode ser usado para quantificar as funções mitocondriais de neutrófilos em condições normais e de doença.

Introdução

As mitocôndrias desempenham um papel importante na bioenergética celular, que gera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, o papel das mitocôndrias se estende à geração e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, regulação do cálcio da matriz citoplasmática e mitocondrial, síntese celular, catabolismo e transporte de metabólitos dentro da célula1. A respiração mitocondrial é essencial em todas as células, pois sua disfunção pode resultar em problemas metabólicos 2, incluindo doenças cardiovasculares3 e uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como degeneração macular relacionada à idade4, Parkinson e Alzheimer5 e doença de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Estudos de microscopia eletrônica em neutrófilos revelaram que há relativamente poucas mitocôndrias7, e elas dependem fortemente da glicólise para sua produção de energia, uma vez que as taxas de respiração mitocondrial são muito baixas8. Entretanto, as mitocôndrias são cruciais para as funções dos neutrófilos, como quimiotaxia9 e apoptose10,11,12. Um estudo anterior revelou uma complexa rede mitocondrial em neutrófilos humanos com alto potencial de membrana. A perda do potencial de membrana mitocondrial é um indicador precoce de apoptose neutrofílica10. O tratamento com o desacoplador mitocondrial carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostrou inibição significativa da quimiotaxia, juntamente com alteração na morfologia mitocondrial 9,10.

Embora a principal fonte de energia para os neutrófilos seja a glicólise, as mitocôndrias fornecem o ATP que inicia a ativação dos neutrófilos alimentando a primeira fase da sinalização purinérgica, que aumenta a sinalização de Ca2+, amplifica a produção de ATP mitocondrial e inicia as respostas funcionais dos neutrófilos13. A disfunção da cadeia respiratória mitocondrial resulta na produção excessiva de espécies reativas tóxicas de oxigênio (EROs) e leva a danos patogênicos14,15,16. NETosis, que é o processo de formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), é uma propriedade crítica dos neutrófilos que os ajuda a lutar contra patógenos17 e contribui para muitas condições patológicas, incluindo câncer, trombose e doenças autoimunes18. As ERO derivadas da mitocôndria contribuem para a NETosis19, o DNA mitocondrial pode ser um componente das NETs18 e a homeostase mitocondrial alterada prejudica a NETosis 20,21,22,23,24. Além disso, durante a diferenciação ou maturação normal, a reprogramação metabólica dos neutrófilos é revertida pela limitação da atividade glicolítica, que se engaja na respiração mitocondrial e mobiliza lipídios intracelulares25,26.

O analisador de fluxo extracelular metabólico pode monitorar e quantificar continuamente a respiração mitocondrial de células vivas e a glicólise. O analisador utiliza um cartucho sensor em formato de placa de 96 poços e dois fluoróforos para quantificar a concentração de oxigênio (O2) e as mudanças de pH. O cartucho do sensor está acima da monocamada da célula durante o ensaio e forma uma microcâmara de ~200 nm de altura. Os feixes de fibras ópticas no analisador são usados para excitar os fluoróforos e detectar as mudanças de intensidade fluorescente. Mudanças em tempo real na concentração de O2 e pH são automaticamente calculadas e mostradas como taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR). Há quatro portas no cartucho do sensor que permitem carregar até quatro compostos em cada poço durante as medições de ensaio. Este protocolo concentra-se em quantificar a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos, bem como as células HL60 semelhantes a neutrófilos, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Protocolo

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da UConn Health de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os experimentos com animais seguiram as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UConn Health (IACUC), e a aprovação para o uso de roedores foi obtida da IACUC da UConn Health de acordo com os critérios descritos no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health. Camundongos C57BL/6 machos com 6 semanas de idade foram utilizados neste estudo.

1. Preparo da placa de 96 poços para o ensaio do fluxo metabólico extracelular

  1. Um cartucho sensor é embalado sobre a placa de 96 poços especialmente projetada para o ensaio de fluxo extracelular metabólico. Hidrate o cartucho levantando-o cuidadosamente e coloque 200 μL/poço de meio de calibração em cada poço da placa subjacente. Coloque o cartucho sobre a placa com calibrador em uma incubadora não-CO2, umidificada, a 37 °C durante a noite para hidratar.
  2. Com base no tipo de célula, utilizar um revestimento específico para a placa de cultura para garantir a adesão celular. Para neutrófilos humanos - células HL60 indiferenciadas e diferenciadas - revestem a placa de 96 poços com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) contendo 50 μL de 5 μg/mL de anticorpo anti-humano CD18 purificado de camundongo (Clone TS1/18) a 4 °C durante a noite. Para neutrófilos de camundongo, revestir a placa de 96 poços com 25 μL de 22,4 μg/mL de Cell Tak em pH 8,0 em NaHCO3 0,1 M à temperatura ambiente (TR) por 20 min.
  3. Lave as placas com 200 μL de PBS estéril duas vezes.
  4. Adicione meio completo aos poços de canto (A1, A12, H1 e H12) da placa de cultura celular (sem células) para correção de fundo nas placas de cultura de células durante a semeadura.
    NOTA: A evaporação durante o revestimento e a calibração podem afetar o volume do meio de calibração e a normalização. Use uma bandeja ou câmara com tecido estéril molhado com água e coloque a placa com o calibrador acima para evitar a evaporação.

2. Preparação e semeadura de células

  1. Preparo do meio de ensaio
    1. Preparar o meio de ensaio adicionando 1 mM de piruvato, 10 mM de glicose e 2 mM de glutamina ao meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco.
  2. Isolamento de neutrófilos de camundongos da medula óssea
    1. Isole neutrófilos de camundongos da medula óssea usando o Kit de Enriquecimento de Neutrófilos de Camundongos, de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) de cetamina (125 mg/kg) e xilazina (12,5 mg/kg) e, em seguida, sacrificar os camundongos por deslocamento cervical.
    3. Colher os fêmures e tíbias, conforme descrito anteriormente27. Resumidamente, corte a pele para expor a perna com os músculos. Corte a articulação do quadril para remover a perna do corpo. Em seguida, remova os músculos para coletar o fêmur e a tíbia.
    4. Corte as extremidades menores dos fêmures e tíbias. Segurando as extremidades do corte, coloque-as em um tubo centrífugo de 0,5 mL com dois orifícios perfurados com agulha de seringa de 25 G no fundo e coloque o tubo de 0,5 mL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL (Figura 1A). Adicionar 50 μL de PBS no tubo de 0,5 mL para evitar o ressecamento das células da medula óssea.
    5. Centrifugar a 5.900 × g em TR por 15 s para coletar a medula óssea no fundo do tubo de 1,5 mL. Ressuspender as células da medula óssea com 1 mL de DMEM. Adicionar 50 μL de soro de rato do kit, misturar suavemente por pipetagem e transferir a suspensão celular para um tubo de ensaio de cultura de poliestireno de 5 mL.
    6. Adicionar 50 μL de cocktail de enriquecimento do Kit de Enriquecimento de Neutrófilos de Rato e incubar durante 15 min em RT. Centrifugar a 300 × g em RT durante 5 min.
    7. Ressuspender as células com 1 mL de DMEM, adicionar 50 μL de coquetel de seleção de biotina do kit, misturar suavemente por pipetagem e incubar por 15 min em TR.
    8. Adicione 150 μL de partículas magnéticas em vórtice do kit, misture suavemente por pipetagem e incube por 10 min no RT.
    9. Adicione ~1,3 mL de DMEM, misture suavemente por pipetagem, coloque o tubo no ímã por 3 min e transfira o sobrenadante contendo neutrófilos purificados de camundongo para um novo tubo de ensaio de cultura de poliestireno de 5 mL invertendo o tubo original junto com o ímã.
    10. Centrifugar a 300 × g em RT por 5 min. Após a remoção do sobrenadante por aspiração a vácuo, ressuspender as células com 1 mL de meio de ensaio.
    11. Conte as células manualmente usando um hemocitômetro.
    12. Ajustar a densidade celular para 1,1 × 106 células/mL adicionando meio de ensaio, semente de 180 μL da suspensão de neutrófilos de camundongo (2 × 105 células) por poço na placa preparada de 96 poços (passos 1.2-1.4) e centrifugar a placa a 300 × g em RT por 3 min sem freio para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa.
    13. Incubar a placa em estufa não CO2, umidificada, a 37 °C por 1 h para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio.
      NOTA: A pureza dos neutrófilos é crítica para o ensaio, uma vez que é um viés potencial. A pureza do isolamento de neutrófilos em camundongos é de 69,9%-88,7% por este protocolo. Existem outros métodos para isolar neutrófilos da medula óssea de camundongos, como a centrifugação por gradiente de densidade28. Existem também kits alternativos de isolamento de neutrófilos de outros fornecedores, baseados na seleção magnética negativa usando os anticorpos monoclonais contra antígenos que não são expressos nos neutrófilos.
  3. Isolamento de neutrófilos humanos do sangue periférico
    1. Adicionar 8 ml de solução de polissacarídeo num tubo de centrifugação de 15 ml e, em seguida, colocar mais de 4 ml de sangue periférico sobre a solução de polissacarídeo sem misturar.
    2. Centrifugar a 550 × g a 20 °C durante 30 min. Faça o rotor desacelerar em 1.
      NOTA: O tempo de separação dos neutrófilos pode variar entre os doadores. É um mínimo de 30 min, e um adicional de 10-20 min pode ser necessário se a separação de neutrófilos não for bem-sucedida.
    3. Observe a separação plasma/plaquetas e células mononucleares após a centrifugação, como mostra a Figura 1B. Remova cuidadosamente o líquido amarelo superior na parte superior (plasma e plaquetas) e a banda turva superior (células mononucleares) sem perturbar a banda turva inferior (neutrófilos) usando uma pipeta de 1 mL.
    4. Coletar a faixa turva inferior e ~3-4 mL do líquido claro abaixo em um novo tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de PBS.
    5. Centrifugar a 400 × g a 20 °C durante 10 min e remover o sobrenadante por aspiração a vácuo.
    6. Ressuspender as células com 5 mL de PBS e centrifugar a 300 × g a 20 °C por 5 min.
    7. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender as células com 1 mL de meio de ensaio.
    8. Conte as células manualmente usando um hemocitômetro.
      NOTA: Como os eritrócitos no sangue não possuem mitocôndrias, a contaminação eritrocitária não afeta o teste de estresse mitocondrial e impede a ativação/priming neutrofílico29,30. Os eritrócitos precisam ser lisados durante a contagem celular para obter uma concentração precisa de neutrófilos. Adicionar 10 μL da suspensão celular a 891 μL de água deionizada por 10-30 s para lisar os eritrócitos e, em seguida, adicionar 99 μL de 10x PBS para equilibrar a pressão osmótica, evitando a lise dos neutrófilos.
    9. Ajustar a densidade celular para 2,2 × 106 células/mL adicionando meio de ensaio, semente de 180 μL de neutrófilos humanos (~4 × 105) por poço na placa preparada de 96 poços e centrifugar a placa a 300 × g em RT por 3 min sem freio para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa.
    10. Incubar a placa em estufa umidificada a 37 °C não -CO2 por 1 h para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio.
      NOTA: A pureza dos neutrófilos é crítica para o ensaio, uma vez que é um viés potencial. A pureza do isolamento de neutrófilos humanos é de 86,6%-96,8%. Existem outros métodos de centrifugação por gradiente de densidade para isolar neutrófilos do sangue humano, incluindo o isolamento de Percoll, bem como uma combinação de isolamento de Ficoll e sedimentação com dextran31.
  4. Cultura de células HL60 e diferenciação dirigida por neutrófilos
    1. Manter células HL60 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 100 μg/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 250 ng/mL de anfotericina B a 37 °C e 5% de CO2.
    2. Para diferenciação dirigida por neutrófilos, manter as células HL60 (células em suspensão) em frasco T25 a uma densidade de 1 × 10 5 células/mL em meio RPMI-1640 contendo FBS a 10%, penicilina 100 μg/mL, estreptomicina 100 μg/mL, anfotericina B 250 ng/mL e dimetilsulfóxido (DMSO) a 37 °C e5 % CO2 por 6 dias.
    3. No dia do ensaio, contar as células manualmente usando o hemocitômetro, centrifugar células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas a 300 × g em TR por 5 min, lavar com DMEM uma vez e ressuspender as células com o meio de ensaio para obter uma densidade celular de 1,39 × 106 células/mL.
    4. Semear 180 μL de células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas (~2,5 × 105) por poço na placa preparada de 96 poços e centrifugar a placa a 300 × g em RT por 3 min sem freio para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa.
    5. Incubar a placa em estufa não CO2, umidificada, a 37 °C por 1 h para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio.
      NOTA: Confirme a adesão completa das células usando um microscópio antes da próxima etapa.

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Figura 1: Diagrama esquemático do isolamento das células da medula óssea e neutrófilos. (A) Coleta de células da medula óssea de um camundongo e (B) isolamento de neutrófilos do sangue humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de célulaCélulas por poçoCompostos/ReagentesConcentração da solução de trabalhoVolume de injeção nos portosConcentração final em poços
Neutrófilos de camundongo2 × 105Oligomicina25 μM20 μL2,5 μM
FCCP7,5 μM17,6 μL0,61 μM
Rotenone Antimicina A mistura10 μM24 μL1 μM
Neutrófilos humanos4 × 105Oligomicina10 μM20 μL1 μM
FCCP12,5 μM22 μL1,25 μM
Rotenone Antimicina A mistura10 μM24 μL1 μM
Células HL60 indiferenciadas ou diferenciadas2.5 × 105Oligomicina25 μM20 μL2,5 μM
FCCP15 μM22 μL1,5 μM
Rotenone Antimicina A mistura10 μM24 μL1 μM

Tabela 1: Número de células e concentrações de reagentes para o teste de estresse mitocondrial.

3. Preparação de compostos no kit de teste de estresse mitocondrial

  1. Abra o kit de teste de estresse mitocondrial e prepare os reagentes.
    NOTA: As diferentes concentrações da solução de trabalho, o volume de injeção nos poços e as concentrações finais nos poços de oligomicina, carbonilcianeto p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) e mistura de rotenona/antimicina A usada para neutrófilos de camundongo, neutrófilos humanos e células HL60 são mostrados na Tabela 1.
    1. Preparar a solução-mãe de oligomicina reconstituindo a oligomicina com 630 μL de meio de ensaio para obter uma solução-mãe de 100 μM.
      NOTA: Recomenda-se usar a solução estoque no mesmo dia.
      1. Preparar solução de trabalho de oligomicina para ensaios de neutrófilos de camundongo e células HL60 misturando 630 μL de solução-mãe com 1.890 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 25 μM.
      2. Preparar a solução de trabalho de oligomicina para o ensaio de neutrófilos humanos misturando 300 μL de solução-mãe com 2.700 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 10 μM.
        NOTA: A ligação da oligomicina à subunidade da placa de base Fo da ATPase Fo/F1 (ATP sintase) impede a reentrada de prótons nas mitocôndrias e inibe a síntese de ATP32. Isso reduz significativamente o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons e do OCR. No entanto, o fluxo de elétrons não cessa completamente devido ao vazamento de prótons através da membrana mitocondrial interna33.
    2. Preparar a solução-mãe FCCP reconstituindo FCCP com 720 μL de meio de ensaio para obter uma solução-mãe de 100 μM.
      1. Preparar a solução de trabalho para o ensaio de neutrófilos no ratinho misturando 300 μL de solução-mãe com 3.700 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 7,5 μM.
      2. Preparar a solução de trabalho para o ensaio de neutrófilos humanos misturando 375 μL de solução-mãe com 2,625 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 12,5 μM.
      3. Preparar a solução de trabalho para o ensaio da célula HL60 misturando 720 μL de solução-mãe com 4.080 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 15 μM.
        NOTA: A adição de FCCP revela a capacidade máxima das mitocôndrias para usar OXPHOS. É um ácido fraco lipossolúvel permeável às mitocôndrias resulta na dissipação do potencial transmembrana. A descarga do gradiente de prótons através da membrana interna mitocondrial e o desvio do fluxo de prótons da Fo/F1 ATP sintase resultam em desacoplamento mitocondrial. Esse efeito de desacoplamento aumenta abruptamente o consumo de oxigênio mitocondrial para preservar o gradiente de prótons34.
    3. Preparar a solução-mãe de rotenona/antimicina A, reconstituindo a mistura de rotenona/antimicina A com 540 μL de meio de ensaio para obter uma solução-mãe de 50 μM.
      1. Preparar a rotenona/antimicina Uma solução de trabalho para todos os ensaios, misturando 540 μL de solução-mãe com 2.160 μL de meio de ensaio para obter uma solução de trabalho de 10 μM.
        NOTA: A rotenona bloqueia o complexo I inibindo a transferência de elétrons dos centros ferro-enxofre do complexo I para a ubiquinona, enquanto a antimicina A bloqueia o complexo III da cadeia de transporte de elétrons, levando a um bloqueio de OXPHOS com uma síntese limitada de ATP35. Desse modo, isso revela respiração não mitocondrial36,37.
  2. Carregue o cartucho com reagentes; preparar a mistura de oligomicina, FCCP e rotenona/antimicina A nas portas A, B e C, respectivamente, no cartucho para preparações injetáveis (Figura 2). Use a inserção do modelo disponível junto com o cartucho para facilitar o carregamento de reagentes para as portas. Encher as portas não utilizadas com 20 μL de meio de ensaio.
    1. Para o ensaio de neutrófilos em camundongos, carregar 20 μL de oligomicina (25 μM; cada poço da placa de 96 poços tem 180 μL de meio de ensaio no início, portanto, a concentração final é de 2,5 μM) nas portas A. Carregar 17,6 μL de FCCP (7,5 μM; concentração final: ~0,61 μM) nas portas B. Carregar 24 μL da mistura rotenona/antimicina A (10 μM; concentração final: ~1 μM) nas portas C.
    2. Para o ensaio de neutrófilos humanos, carregar 20 μL de oligomicina (10 μM; cada poço da placa de 96 poços tem 180 μL de meio de ensaio no início, portanto, a concentração final é de 1 μM) nos portos A. Carregar 22 μL de FCCP (12,5 μM; concentração final: ~1,25 μM) nas portas B. Carregar 24 μL da mistura rotenona/antimicina A (10 μM; concentração final: ~1 μM) nas portas C.
    3. Para o ensaio celular HL60 e dHL60, carregar 20 μL de oligomicina (25 μM; cada poço da placa de 96 poços tem 180 μL de meio de ensaio no início, portanto, a concentração final é de 2,5 μM) nos portos A. Carregar 22 μL de FCCP (15 μM; concentração final: ~1,5 μM) nas portas B. Carregar 24 μL da mistura rotenona/antimicina A (10 μM; concentração final: ~1 μM) nas portas C.
      NOTA: Pipetar a solução do medicamento no porto sem tocar no fundo do porto. Não bata na placa após o carregamento para evitar vazamentos, pois os líquidos são retidos pelas forças capilares. Os poços de fundo da placa de cultura e as portas do cartucho do sensor são carregados com meio de ensaio ou com a mesma porta de carregamento de reagentes como nos poços de amostra para normalizar o efeito dos reagentes sobre os valores de fundo. Os reagentes devem ser adicionados às respectivas portas sem levantar o cartucho da placa de serviço público que contém o calibrador, a fim de evitar qualquer armadilha de ar. Preencha a última porta de todos os poços com o meio como mostrado na Figura 2.

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Figura 2: O cartucho de ensaio de estresse mitocondrial e suas portas de injeção. A imagem mostra o cartucho do ensaio de estresse mitocondrial e uma imagem ampliada mostrando o carregamento de drogas/meio individuais para os portos. Abreviatura: FCCP = carbonilcianeto p-trifluorometoxifenilhidrazona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Execução do ensaio de estresse mitocondrial

  1. Ligue o analisador metabólico e o computador, abra o software Wave e clique em Aquecedor ligado para configurar a máquina a 37 °C com pelo menos 5 horas de antecedência. Depois de atingir a temperatura, o canto inferior esquerdo do software de onda mostra-se pronto.
  2. Abra um modelo para o kit de ensaio de estresse mitocondrial no software. Clique em Definição de Grupo na barra de menu superior.
  3. Pré-configurar separadamente cada definição no lado esquerdo, como estratégias de injeção, pré-tratamentos, meios de ensaio e tipos celulares (biomaterial usado).
  4. Clique em estratégias de injeção no lado esquerdo, em seguida, clique em Adicionar e nomeie a condição de injeção como neutrófilos humanos/neutrófilos de camundongo/HL60. Selecione a porta A-D clicando em cada uma e clique em Adicionar composto e digite Oligomicina/FCCP/Rotenone Antimicina A com as respectivas concentrações (Tabela 1).
  5. Clique em pré-tratamento no lado esquerdo, em seguida, clique em Adicionar e nomeá-los como CD18 e Cell Tak separadamente. Clique no biomaterial usado no lado esquerdo, depois clique em Adicionar e nomeie-os como Neutrófilos humanos, neutrófilos de camundongo e HL60 /dHL60 com densidade de semeadura.
  6. Defina os grupos clicando em Adicionar grupo (por exemplo, para o ensaio de neutrófilos humanos) e clicando na definição subjacente (por exemplo, Estratégias de injeção conforme Tabela 1 – Neutrófilos humanos, Pré-tratamento como CD18 e tipo de célula como neutrófilos humanos).
  7. Clique em Mapa de Placas no menu superior para observar todos os grupos, com definições no lado esquerdo e o mapa de placas à direita. Arraste e solte para adicionar cada poço ao grupo, mantendo os quatro poços de canto como Plano de fundo (padrão).
  8. Configure o protocolo clicando em Protocolo no menu superior e defina três ciclos de mistura de linha de base, oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A, definindo o tempo como Mix como 3 min, Rest como 0 min e Measurement como 7 min.
  9. Vá para a página Executar ensaio , forneça as informações de resumo do projeto para referência e clique em Iniciar execução.
  10. Forneça o local para salvar os arquivos, para que todos os resultados sejam salvos após a conclusão do ensaio.
  11. Após o carregamento automático do ensaio, aguarde a abertura da bandeja para colocar o cartucho e a placa do sensor com 200 μL de calibrador (passo 1.1). Defina a direção do código de barras do cartucho voltada para a direita. Execute a calibração clicando em Estou pronto, o que leva aproximadamente 20 min.
  12. Após a calibração, clique em Abrir bandeja. Substitua a placa pela placa semeada em célula e clique em Placa de célula de carga para continuar o ensaio.
  13. Após a conclusão do ensaio, os dados são salvos automaticamente. Clique em Exibir resultados e exporte-os como uma planilha ou outro arquivo de software de análise.
  14. Gráfico e análise dos dados (Figura 3 e Figura 4).
  15. Calcular parâmetros respiratórios, incluindo respiração mitocondrial basal, respiração ligada a vazamento de prótons, respiração ligada a ATP, respiração máxima, capacidade respiratória ociosa e respiração não mitocondrial (Figura 4A)38,39,40,41.
    1. Calcular a respiração mitocondrial basal subtraindo o valor de OCR medido após a adição de mistura de rotenona/antimicina A do OCR antes de injetar oligomicina (Figura 4A, a).
    2. Calcular a respiração ligada ao vazamento de prótons subtraindo o valor de OCR após injeção de mistura de rotenona/antimicina A do valor de OCR medido após injeção de oligomicina (Figura 4A,b).
    3. Estimar a respiração ligada ao ATP calculando a diferença entre a respiração mitocondrial basal e a respiração ligada ao extravasamento de prótons. Subtrair o primeiro valor de OCR medido após a injeção de oligomicina do primeiro valor de OCR antes da injeção de oligomicina (Figura 4A,c).
    4. A respiração máxima é a taxa respiratória máxima que uma célula pode atingir após a adição do FCCP. Calcule isso subtraindo o valor de OCR após a injeção da mistura de rotenona/antimicina A do valor de OCR medido após a injeção de FCCP (Figura 4A,d).
    5. A capacidade respiratória ociosa refere-se à capacidade de uma célula de atender à maior demanda de energia através do OXPHOS. Calcule isso encontrando a diferença entre a respiração máxima e a respiração mitocondrial basal (Figura 4A, e).
    6. A respiração não mitocondrial é a quantidade de oxigênio consumida por fontes não mitocondriais. Medir isso após a adição da mistura de rotenona/antimicina A (Figura 4A,f).
  16. Realizar análise estatística utilizando o teste t de Student para comparar diferentes parâmetros respiratórios de células HL60 indiferenciadas e diferenciadas. Considere-se que p < 0,05 é estatisticamente significante.
    NOTA: Réplicas com valores de OCR ou ECAR abaixo de zero são consideradas um erro na preparação da amostra, injeção de composto ou medição. Eles são excluídos de análises futuras.

Resultados

Dinâmica representativa de OCR é mostrada indicando as alterações da respiração mitocondrial em resposta à oligomicina, FCCP e mistura de rotenona/antimicina A de neutrófilos de camundongos (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) e células HL60 indiferenciadas e diferenciadas (Figura 3C). Em todas as células, o tratamento com oligomicina diminui o valor de OCR inibindo o canal de prótons da ATP sintase; O tratamento...

Discussão

O procedimento padrão que mede a respiração mitocondrial de neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico é limitado por muitos fatores, incluindo número celular, crescimento celular e viabilidade. Cada concentração de composto varia entre o tipo e a fonte de células neste ensaio. Oligomicina e rotenona/antimicina A são usadas principalmente em uma concentração semelhante entre a maioria dos tipos celulares. No entanto, como a frequência respiratória máxima induzida pelo FCCP varia ent...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Anthony T. Vella e à Dra. Federica Aglianoin do Departamento de Imunologia da UConn Health por seu treinamento no uso do analisador de fluxo extracelular metabólico, e à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos. Agradecemos à Dra. Geneva Hargis, da UConn School of Medicine, por sua ajuda na redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R01HL145454), Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R35GM147713 e P20GM139763), um fundo de inicialização da UConn Health e uma bolsa de reentrada na carreira da Associação Americana de Imunologistas.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
37 °C non-CO2 incubatorPrecisionEconomy Model 2EGInstrument
BiorenderSoftware Application
CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveCorning102416-100Reagent
EasySep MagnetSTEMCELL18000Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kitSTEMCELL19762AReagents
Graphpad Prism 9Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%)GeminiBio800-120Reagents
Ketamine (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Anesthetic
PBSCytivaSH30256.01Reagents
Plate bucketsEppendorfUL155Accessory
PolymorphPrepPROGEN1895 (previous 1114683)polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibodyBiolegend302102Clone TS1/18
RPMI 1640 MediumGibco11-875-093Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzerAgilentXFe96Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62Rotor
Vactrap 2 Vacum TrapFox Lifesciences3052101-FLSInstrument
WaveSoftware Application
XF 1.0 M Glucose SolutionAgilent103577-100Reagent
XF 100 mM Pyruvate SolutionAgilent103578-100Reagent
XF 200 mM Glutamine SolutionAgilent103579-100Reagent
XF DMEM mediumAgilent103575-100Reagent
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Material
Xylazine (AnaSed Injection)DAILYMEDNDC 59399-110-20Anesthetic

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