卵巢组织卵母细胞体外成熟 以保持生育能力

摘要

这里介绍的是卵巢组织卵母细胞体外 成熟 （OTO-IVM），这是医学辅助生殖 （MAR） 实验室中的一种可用技术，为需要卵巢组织冷冻保存的患者提供了现实的额外生育能力保留选择。

摘要

成熟卵母细胞玻璃化术是保持有不孕风险的女性生育能力的标准护理。然而，卵巢组织冷冻保存 （OTC） 仍然是需要紧急开始性腺毒性治疗的女性或青春期前儿童保持生育能力的唯一选择。在卵巢皮层准备冷冻保存期间，髓质组织被去除。生长中的窦卵泡位于卵巢皮层-延髓界面的边界，并在此过程中破裂，释放出卵丘-卵母细胞复合物 （COC）。通过彻底检查培养基和碎裂的髓质组织，可以在不干扰 OTC 程序的情况下识别这些未成熟的卵丘-卵母细胞复合物。卵巢组织来源的未成熟卵母细胞可以在体外成功成熟 ， 为保持生育能力创造了额外的配子来源。如果 OTC 是在医疗辅助生殖实验室内或附近进行的，则所有必要的 体外 成熟 （IVM） 和卵母细胞玻璃化工具都可用。此外，在缓解和生育意愿后，患者有多种生育能力恢复选择：卵巢组织移植或在玻璃化/加热卵母细胞授精后进行胚胎移植。因此，卵巢组织卵母细胞体外 成熟 （OTO-IVM） 可能是一种有价值的辅助生育力保存技术。

引言

计划接受性腺毒性治疗、变性治疗或具有卵巢早衰遗传易感性的女性的生育力保存 （FP） 选择取决于患者的健康状况和年龄、可用的时间范围、治疗类型、患者的偏好以及首选生育中心可用的 FP 程序。在医学辅助生殖 （MAR） 实验室周期中用促性腺激素刺激卵巢和取卵后获得的成熟卵母细胞玻璃化被认为是 FP ^1,2 的首选选择。然而，对于青春期前女孩、需要紧急开始性腺毒性治疗或性腺切除术的妇女，或因性腺毒性治疗而导致永久性闭经风险高的妇女，不可能使用促性腺激素刺激卵巢，以及卵巢组织冷冻保存 （OTC），这是 FP ^1,2 的一种公认且有效的技术^，3 是唯一的选项。OTC 的目标是在卵巢皮层组织中冷冻保存数千个休眠的原始卵泡，在将冷冻/解冻的组织移植到剩余的卵巢或仔细筛选代表性组织碎片中的微小残留病后，这些卵泡可以在腹膜袋中恢复生长。

为了获得适合冷冻保存的 1-2 mm 厚的皮质碎片，需要去除柔软的髓质组织。这种髓质组织通常需要在不同发育阶段生长的卵泡，这些卵泡会逃离僵硬的卵巢皮层，以便其生长和扩张⁴。多年来，几个实验室一直在研究使用体外成熟 （IVM^{） 制备}卵巢皮质碎片后从残留髓质组织中的卵泡中回收的这些卵母细胞的潜力^5,6,7，称为卵巢组织卵母细胞 IVM （OTO-IVM）。窦卵泡，即使是直径小于 6 毫米的卵泡，也含有被卵丘细胞包围的未成熟卵母细胞，这些卵母细胞可以使用 IVM 系统成熟、受精并发育成健康的婴儿 ^8,9。IVM 被认为是有卵巢过度刺激综合征 （OHSS） 风险的女性的标准护理，例如多囊卵巢综合征 （PCOS） 患者。然而，在 FP 领域，在有卵巢刺激禁忌症的情况下，可用于 IVM 的数据有限;经阴道收集的卵母细胞的 IVM 仍然被认为是创新的，而 OTO-IVM 被认为是实验性的 ^2,10。也就是说，OTO-IVM 后第一批活产的报告^11、12、13 强调了当患者 FP 需要 OTC 时使用 OTO-IVM 作为附加技术的潜力¹⁴。

本研究提供了在 MAR 实验室采用 OTO-IVM 的技术细节，并说明了在单个中心获得的结果。

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研究方案

目前关于 OTO-IVM 的研究已获得 UZ-Brussels 当地伦理委员会的批准（项目 2008/068 和项目 2022/303 的附录）。所有患者均签署书面知情同意书。每位患者由生殖医学专科医生、导航护士和转诊肿瘤学家单独评估，以制定最佳的 FP 治疗计划，同时考虑到患者的偏好¹⁴。简而言之，符合 OTC 条件的患者急需 FP 且年龄小于 36 岁¹⁴ 岁。要将 OTC 与 OTO-IVM 联合使用，不能在 OTC 之前的 6 个月内进行化疗或放疗。

1. 实验室环境和人员

1. 在 A 级层流柜中执行 OTC。
2. 由两名作员进行 OTC：一名作员在层流柜中无菌工作，另一名作员使用杀菌剂和杀孢子剂去污喷雾剂清洁所有非无菌材料，并将无菌材料和用品移交给第一名作员。在台式冷却器盖 （± 4 °C） 上处理卵巢皮层。
3. 在加热台 （37 °C） 的 MAR 实验室中，使用立体显微镜在第二个层流柜中进行卵丘-卵母细胞复合物 （COC） 搜索。
4. 从延髓残余物中取出 COC（第 3 部分和第 4 部分）并启动 IVM 过程（第 5 部分）。这由第三个作员完成。

2. 培养基制备

注：此程序使用五种类型的培养基（详见下文）：OTC 处理培养基、OTC 冷冻培养基、搜索培养基、LAG 培养基和 IVM 培养基。制备培养基时，应在流通柜中无菌工作，如第 1 节所述。每个程序都使用新的、未开封的试剂，并保持所有用于确定所生产培养基无菌的一次性用品的无菌性。

1. OTC 处理介质
   1. 用 4 mg/mL 人血清白蛋白 （HSA）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素补充 Leibovitz 的 L15 培养基（参见 材料表）。
   2. 将 OTC 处理培养基冷藏直至使用（最长 2 天）。
      注：使用 OTC 处理介质冲洗和处理卵巢组织，并冷使用 （0-4 °C）。
2. OTC 冻存培养基
   1. 用 1.5 M 二甲基亚砜 （DMSO） 和 4 mg/mL HSA 补充 Leibovitz 的 L15 培养基。
   2. 将 OTC 冻存培养基冷藏至使用（最长 2 天）。
3. 搜索媒介
   注：Search 培养基（一种用于卵母细胞处理的 HEPES 缓冲培养基）是市售的（参见 材料表）并且可直接使用。使用搜索培养基冲洗过滤器并收集 COC，同时在延髓片段之间搜索 COC（第 4 节）。
   1. 用 6 mL 搜索培养基填充 6 个 14 mL 圆底无菌试管。
   2. 用 500 μL 搜索培养基制备一个 4 孔培养皿，覆盖 350 μL 油（参见 材料表）。
   3. 在卵巢组织到达之前，将试管和 4 孔培养皿在 37 °C 下加热至少 1 小时。HEPES 缓冲培养基不需要 CO₂ 孵育。
4. LAG 培养基
   注意：市售的 IVM 系统（参见 材料表）包括两种不同的培养基：LAG 培养基和 IVM 培养基，需要补充，如下所述。LAG 培养基用于冲洗 COC，但也可以在 IVM 培养基中 IVM 之前使用 2-3 小时的孵育期，如 IVM 系统的插入所建议的那样。
   1. 使用市售的即用型 LAG 培养基（参见 材料表）。
5. IVM 培养基
   1. 用 10 mg/mL HSA、75 mIU/mL 促卵泡激素 （FSH） 和 100 mIU/mL 人绒毛膜促性腺激素 （hCG） 补充市售 IVM 培养基。
   2. 准备一个 4 孔培养皿，其中有 1 孔 LAG 培养基和 3 孔补充的 IVM 培养基：500 μL 培养基，覆盖有 350 μL 油覆盖层。
   3. 在 37 °C 的培养箱中，在 6% CO₂ 和 20% O₂ 中平衡培养皿过夜，这是 IVM 培养的最佳环境。

3. 卵巢皮层准备

注意：腹腔镜全卵巢切除手术按照 Jadoul 等人 ¹⁵ 的描述进行。

1. 卵巢到达实验室后，通过将卵巢转移到装有 OTC 处理培养基的 100 mm 培养皿中，在 OTC 处理培养基中洗涤卵巢（步骤 2.1）两次。
2. 用手术刀将卵巢纵向切成两半（图 1A）。
3. 用新手术刀在髓质组织中垂直和水平做几个切口。避免损伤皮层。用手术刀轻轻刺穿延髓内各种大小的坚硬窦卵泡，以释放 OTC 处理介质中的卵泡液。
4. 用手术剪刀剪掉柔软的髓质组织（图 1B）。此过程可能需要几分钟时间。
5. 在修剪过程中，将卵巢壳放入装有新鲜 OTC 处理介质的新培养皿中。
6. 将带有髓质碎片和释放的卵泡液（图 1C）的培养皿转移到第二个流动柜中，以开始寻找 COC。
7. 重复步骤 3.4 至 3.6，直到获得所需的皮层组织厚度 （1-2 mm）。
8. 将皮质切成大约 8 毫米 x 5 毫米的小块。
9. 在 100 mm 培养皿中，在大约 25 mL 的 OTC 冷冻培养基（步骤 2.2）中连续孵育碎片 3 次 10 分钟。
10. 将一块放入冻存管中的 800 μL OTC 冻存培养基中。
11. 在由温度控制器控制的冷冻室中使用缓慢冷冻方案冷冻保存卵巢组织（参见 材料表）：4 °C 至 -7 °C，-2 °C/min，-7 °C 手动接种，-0.3 °C/min -7°C 至 -40 °C，-10 °C/min -100 °C，-10 °C/min， 并在 -100 °C 下将冻存管浸入液氮中并储存。

4. 搜索 COC

1. 准备层流柜以进行 COC 搜索。
   1. 在层流柜中的立体显微镜下的加热台上加热 60 mm 培养皿。
   2. 将装有 6 mL 预热 Search 培养基（步骤 2.3.1）的 14 mL 试管放入加热块中，将预热的 4 孔培养皿和 Search 培养基放在层流柜中显微镜下的加热台上。
   3. 将无菌过滤器（细胞过滤器，70 μm 网孔大小;参见 材料表）自下而下放入培养皿中。
   4. 取 290-310 μm 玻璃毛细管使用：请勿使用小于 290-310 μm 的毛细管，以避免损坏卵母细胞-卵丘细胞连接。
   5. 确保有 1 mL 滤芯吸头和 1 mL 移液器。
2. 从 OTC 层流柜 （4 °C） 中取出带有髓质碎片的第一个培养皿，并尽快将培养皿放在 IVM 层流柜中的加热台 （37 °C） 上。
   注意：第一盘髓质碎片和卵泡液可能被来自充满血液的排卵卵泡或卵巢本身脉管系统的血液污染。红细胞使清晰的视力模糊，使寻找 COC 变得复杂。必须去除受污染的培养基以洗去红细胞（参见步骤 4.3）。
3. 按照以下步骤去除血细胞污染。
   1. 在滤膜（70 μm 细胞过滤器）上吸取 2 mL Search 培养基以润湿膜，然后将捕获培养基的培养皿放在加热台上。
   2. 将过滤器倒置，用手柄将其靠在新培养皿的边缘，使过滤器底部形成一个斜坡。
   3. 使用 1 mL 尖端在髓质碎片之间收集血液污染的培养基，然后轻轻吹过滤膜（图 1D）以捕获受污染培养基中存在的 COC。
   4. 重复步骤 4.3.3，直到去除大部分受血液污染的培养基。
   5. 立即将新鲜的 Search 培养基倒在髓质碎片上，以始终保持 COC 悬浮在培养基中。
   6. 用 2 mL 搜索培养基轻轻冲洗倾斜的滤膜，以冲洗掉滤膜上的红细胞。
   7. 将过滤器自下而下放入新培养皿中，将 3-4 mL 搜索培养基倒入过滤器中，以将 COC 从滤膜中排出到填充培养皿的培养基中。取下过滤器。为确保滤膜不会变干（以及任何尚未从中排出的可能的 COC），请将过滤器自下而下浸入第一个培养皿中，该培养皿用于首次润湿过滤器。
   8. 立即在放大倍数为 10 倍-50 倍的立体显微镜下目视检查排出的培养基中是否有 COC。寻找透明半透明的卵母细胞，周围有深色、致密的卵丘细胞边缘（图 1E）。在培养皿中旋转培养基，然后再次检查培养基。
   9. 在新培养皿中第二次冲洗过滤器，并检查排出的培养基中是否有 COC。
   10. 检查过滤器浸入的培养皿中的培养基中是否有剩余的 COC。
   11. 用玻璃毛细管将 COC 转移到含有 Search 培养基的 4 孔培养皿中（图 1E）。始终将菜肴放在加热的舞台上。
4. 用髓质碎片从培养皿中去除污染的血细胞并用透明的搜索培养基补充培养皿后，在髓质碎片之间搜索 COC。使用玻璃毛细管在髓质碎片周围移动，并在培养皿中旋转培养基以找到 COC。如果怀疑存在卵母细胞，用 1 mL 注射器上的结核菌素针头拉开大的髓质碎片。
5. 用 Search 培养基在 4 孔培养皿中收集所有完整的 COC。
   注意：在典型的 OTC 程序中，使用三个连续的 100 毫米培养皿从延髓中切除皮质组织，其中卵巢壳被移动到带有新鲜培养基的新培养皿中，残余物被转移到 IVM 流中以进行 COC 搜索。通常，只有第一道菜需要去除血细胞;在第二和第三个培养皿中，存在较少的髓质碎片，并且直接在碎片之间和培养基中进行 COC 搜索。

5. COCs 的 IVM

1. 在干净的孔中用 Search 培养基冲洗 COC。
2. 将预平衡的 IVM 培养皿（包含一孔 LAG 培养基和三孔 IVM 培养基的 4 孔培养皿）从培养箱移至 IVM 流动柜中的加热台。
3. 用患者信息标记含有 COC 的 IVM 培养皿。
4. 在 LAG 培养基 （2-3 s） 中冲洗 COC，并将它们放入补充有 IVM 培养基的三个孔之一中。以每孔约 10 个 COC 的组培养 COC。从培养物中省略裸露的卵母细胞 - 没有附着的卵丘细胞 - 因为已知它们的发育潜力严重受损。
5. 将培养皿置于 37 °C、6% CO₂ 和 20% O₂ 的培养箱中 30 小时。

6. 处理成熟卵母细胞

1. 在 IVM 30 小时后，通过短暂暴露于 80 IU 透明质酸酶（参见 材料表）和轻柔的机械移液，剥离卵母细胞周围的卵丘细胞。
2. 通过挤压第一极体来识别成熟的卵母细胞。
3. 根据患者的喜好对成熟的卵母细胞进行玻璃化或授精。
   注意：如果 IVM 30 小时后的成熟度检查超出可接受的工作时间，则 IVM 持续时间可以缩短至 28 小时或延长至 42 小时。如果在 30 小时后仅获得少数成熟卵母细胞，则可以将未成熟的卵母细胞在原始 IVM 孔中额外培养过夜，不含卵丘细胞，并在第二天早上成熟时用于玻璃化或胞浆内单精子注射 （ICSI）。

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结果

在过去十年中，98 例接受卵巢切除术或卵巢活检治疗 OTC 的患者也接受了 OTO-IVM。此处提供的结果是 ^7,13 之前发布的临床计划的更新。在卵巢组织处理过程中获得的未成熟卵母细胞主要在体外成熟 30 小时。然而，出于实际原因或由于成熟度低，允许更灵活的成熟时间，范围为 28-42 小时。患者主要选择卵母细胞玻璃化术 （...

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讨论

FP 程序的首要任务始终是根据已在临床验证的标准作方案纵和冷冻卵巢皮层。FP 的一个缺点是已发表的文献中缺乏关于 OTC 和 OTO-IVM 的标准方案。很难评估技术和适应的效率和有效性，因为在临床环境中冷冻/玻璃化和解冻/升温之间存在很大的时间间隔。如果对 OTC 方案进行更改以提高 OTO-IVM 的效率，那么在冷冻保存和解冻时验证适应后的 OTC 方案是否适用于组织健康至关?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal