Eizelle des Eierstockgewebes - In-vitro-Reifung zur Erhaltung der Fruchtbarkeit

Zusammenfassung

Hier wird die In-vitro-Reifung von Ovarialgewebe-Eizellen (OTO-IVM) vorgestellt, eine zugängliche Technik in einem Labor für medizinisch assistierte Reproduktion (MAR), die Patientinnen, die eine Kryokonservierung von Eierstockgewebe benötigen, realistische zusätzliche Optionen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bietet.

Zusammenfassung

Die Vitrifizierung reifer Eizellen ist der Behandlungsstandard zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei Frauen mit dem Risiko einer Unfruchtbarkeit. Die Kryokonservierung des Ovarialgewebes (OTC) ist jedoch immer noch die einzige Möglichkeit, die Fruchtbarkeit bei Frauen zu erhalten, die dringend mit einer gonadotoxischen Behandlung beginnen müssen, oder bei präpubertären Kindern. Bei der Vorbereitung der Ovarialrinde für die Kryokonservierung wird das Markgewebe entfernt. Wachsende Antralfollikel befinden sich an der Grenze der Kortex-Medullär-Schnittstelle des Eierstocks und werden während dieses Prozesses aufgebrochen, wodurch ihr Kumulus-Eizell-Komplex (COC) freigesetzt wird. Durch eine gründliche Inspektion des Mediums und des fragmentierten Markgewebes können diese unreifen Kumulus-Eizell-Komplexe identifiziert werden, ohne das OTC-Verfahren zu beeinträchtigen. Die aus dem Eierstockgewebe gewonnenen unreifen Eizellen können erfolgreich in vitro gereift werden, wodurch eine zusätzliche Quelle für Gameten für die Erhaltung der Fruchtbarkeit entsteht. Wenn OTC in oder in der Nähe eines Labors für medizinisch assistierte Reproduktion durchgeführt wird, können alle notwendigen In-vitro-Reifungs- (IVM) und Eizellvitrifikationswerkzeuge zur Verfügung stehen. Darüber hinaus hat die Patientin bei Remission und Kinderwunsch mehrere Möglichkeiten zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit: Transplantation von Eierstockgewebe oder Embryotransfer nach der Insemination von vitrifizierten/erwärmten Eizellen. Daher kann die In-vitro-Reifung des Ovarialgewebes (OTO-IVM) eine wertvolle ergänzende Technik zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sein.

Einleitung

Die Optionen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit (FP) für Frauen, die für eine gonadotoxische Behandlung, eine geschlechtsangleichende Therapie oder Frauen mit einer genetischen Veranlagung für vorzeitiges Eierstockversagen geplant sind, hängen von der Gesundheit und dem Alter der Patientin, dem verfügbaren Zeitrahmen, der Art der Behandlung, den Vorlieben der Patientin und den FP-Verfahren ab, die im Fertilitätszentrum der Wahl verfügbar sind. Die Vitrifizierung reifer Eizellen, die nach Stimulation der Eierstöcke mit Gonadotropinen und Eizellentnahme in einem Laborzyklus der medizinisch assistierten Reproduktion (MAR) gewonnen wurden, gilt als bevorzugte Option für FP ^1,2. Bei präpubertären Mädchen, Frauen, bei denen der dringende Beginn einer gonadotoxischen Behandlung oder Gonadektomie erforderlich ist, oder bei Frauen mit einem hohen Risiko für dauerhafte Amenorrhoe aufgrund einer gonadotoxischen Behandlung ist jedoch ein Zyklus der Stimulation der Eierstöcke mit Gonadotropinen nicht möglich, und die Kryokonservierung des Ovarialgewebes (OTC), die eine akzeptierte und gültige Technik für FP ^1,2 ist^{, 3} ist die einzige Option. Das Ziel der OTC ist die Kryokonservierung von Tausenden von ruhenden Primordialfollikeln im Gewebe der Ovarialrinde, die nach der Transplantation von gefrorenem/aufgetautem Gewebe auf den verbleibenden Eierstock oder in einer Peritonealtasche nach dem sorgfältigen Screening der minimalen Resterkrankung in repräsentativen Gewebefragmenten wieder wachsen können.

Um kortikale Fragmente von 1-2 mm Dicke zu erhalten, die für die Kryokonservierung geeignet sind, muss das weiche Markgewebe entfernt werden. Dieses medulläre Gewebe beinhaltet typischerweise wachsende Follikel in verschiedenen Entwicklungsstadien, die der steifen Ovarialrinde entkommen, um ihr Wachstum und ihre Ausdehnung zu ermöglichen⁴. Seit vielen Jahren untersuchen mehrere Laboratorien das Potenzial dieser Eizellen, die aus Follikeln gewonnen wurden, die sich im medullären Geweberest befinden, nachdem die Kortikalfragmente der Eierstöcke mittels In-vitro-Reifung (IVM) vorbereitet ^wurden5,6,7, die als Oozyten-OVIT IVM (OTO-IVM) bezeichnet wird. Antralfollikel, auch solche mit einem Durchmesser von weniger als 6 mm, enthalten unreife Eizellen, die von Kumuluszellen umgeben sind, die mit einem IVM-System reifen, befruchten und sich zu gesunden Babys entwickeln können ^8,9. IVM gilt als Standardbehandlung für Frauen mit einem Risiko für das ovarielle Hyperstimulationssyndrom (OHSS), wie z. B. Patientinnen mit polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS). Im Bereich der FP gibt es jedoch nur begrenzte Daten für IVM in Fällen mit einer Kontraindikation für die Stimulation der Eierstöcke; Die IVM von transvaginal entnommenen Eizellen gilt nach wie vor als innovativ, und die OTO-IVM gilt als experimentell ^2,10. Die Berichte über die ersten Lebendgeburten nach OTO-IVM^11,12,13 unterstreichen jedoch das Potenzial des Einsatzes von OTO-IVM als Zusatztechnik, wenn OTC für FP bei Patienten erforderlich ist¹⁴.

Diese Studie enthält technische Details zur Einführung von OTO-IVM im MAR-Labor und veranschaulicht die Ergebnisse, die in einem einzigen Zentrum erzielt wurden.

Protokoll

Die vorliegende Studie zu OTO-IVM wurde von der lokalen Ethikkommission der UZ-Brüssel genehmigt (Anhang zu Projekt 2008/068 und Projekt 2022/303). Alle Patienten unterschrieben eine schriftliche Einverständniserklärung. Jeder Patient wurde individuell von einem Facharzt für Reproduktionsmedizin, einer Navigator-Krankenschwester und dem überweisenden Onkologen beurteilt, um den optimalen FP-Behandlungsplan unter Berücksichtigung der Präferenzen des Patienten zusammenzustellen¹⁴. Kurz gesagt, Patienten, die für OTC in Frage kommen, benötigen dringend FP und sind jünger als 36 Jahre und¹⁴ Jahre. Um OTC mit OTO-IVM zu kombinieren, darf in den 6 Monaten vor der OTC keine Chemo- oder Strahlentherapie verabreicht worden sein.

1. Laborumgebung und Personal

1. Führen Sie OTC in einem Laminar-Flow-Schrank der Klasse A durch.
2. Führen Sie OTC mit zwei Bedienern durch: einer arbeitet aseptisch in der Laminal-Flow-Werkstatt und ein zweiter reinigt alle nicht sterilen Materialien mit einem Bakterizid- und Sporizid-Dekontaminationsspray und übergibt Materialien und Verbrauchsmaterialien aseptisch an den ersten Bediener. Verarbeiten Sie die Ovarialrinde auf einem Tischkühldeckel (± 4 °C).
3. Führen Sie die Suche nach dem Kumulus-Eizell-Komplex (COC) in einem zweiten Laminar-Flow-Schrank mit einem Stereomikroskop in einem MAR-Labor auf einem beheizten Tisch (37 °C) durch.
4. Führen Sie die Entnahme des COC aus den medullären Resten durch (Abschnitte 3 und 4) und leiten Sie den IVM-Prozess ein (Abschnitt 5). Dies übernimmt ein dritter Operator.

2. Vorbereitung der Medien

HINWEIS: Für dieses Verfahren werden fünf Medientypen verwendet (siehe unten): OTC-Handhabungsmedium, OTC-Gefriermedium, Suchmedium, LAG-Medium und IVM-Medium. Arbeiten Sie bei der Medienvorbereitung aseptisch im Durchflussschrank, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Verwenden Sie für jeden Eingriff neue, ungeöffnete Reagenzien und erhalten Sie die Sterilität aller verwendeten Einwegartikel, um die Sterilität der hergestellten Medien zu ermitteln.

1. OTC-Handhabungsmedium
   1. Ergänzen Sie das L15-Medium von Leibovitz mit 4 mg/ml humanem Serumalbumin (HSA), 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (siehe Materialtabelle).
   2. Bewahren Sie das OTC-Handhabungsmedium bis zur Verwendung (maximal 2 Tage) im Kühlschrank auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie OTC-Handhabungsmedium, um das Eierstockgewebe zu spülen und zu verarbeiten, und verwenden Sie es kalt (0-4 °C).
2. OTC-Gefriermedium
   1. Ergänzen Sie das L15-Medium von Leibovitz mit 1,5 M Dimethylsulfoxid (DMSO) und 4 mg/ml HSA.
   2. Bewahren Sie das OTC-Gefriermedium bis zur Verwendung (maximal 2 Tage) im Kühlschrank auf.
3. Medium durchsuchen
   HINWEIS: Das Suchmedium (ein HEPES-gepuffertes Medium für die Handhabung von Eizellen) ist im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle) und gebrauchsfertig. Verwenden Sie das Suchmedium, um den Filter zu spülen und das KOK zu sammeln, während Sie zwischen den Markfragmenten nach KOK suchen (Abschnitt 4).
   1. Füllen Sie sechs sterile 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden mit 6 mL Suchmedium.
   2. Bereiten Sie eine 4-Well-Schüssel mit 500 μl Suchmedium zu, das mit 350 μl Öl bedeckt ist (siehe Materialtabelle).
   3. Erhitzen Sie die Röhren und die 4-Well-Schale mindestens 1 h lang bei 37 °C, bevor das Eierstockgewebe ankommt. HEPES-gepufferte Medien benötigen keine CO₂ -Inkubation.
4. LAG mittel
   HINWEIS: Das kommerziell erhältliche IVM-System (siehe Materialtabelle) besteht aus zwei verschiedenen Medien: LAG-Medium und IVM-Medium, das wie unten beschrieben ergänzt werden muss. LAG-Medium wird zum Spülen der KOK verwendet, kann aber auch für eine Inkubationszeit von 2-3 Stunden vor der IVM in IVM-Medium verwendet werden, wie aus der Einlage des IVM-Systems hervorgeht.
   1. Es ist das handelsübliche, gebrauchsfertige LAG-Medium zu verwenden (siehe Materialtabelle).
5. IVM mittel
   1. Ergänzen Sie das im Handel erhältliche IVM-Medium mit 10 mg/ml HSA, 75 mIU/ml follikelstimulierendem Hormon (FSH) und 100 mIU/ml humanem Choriongonadotropin (hCG).
   2. Bereiten Sie eine 4-Well-Kulturschale mit einer Vertiefung LAG-Medium und drei Vertiefungen mit supplementiertem IVM-Medium vor: 500 μl Medium, bedeckt mit 350 μl Ölauflage.
   3. Äquilibrieren Sie die Schale über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C in 6 % CO₂ und 20 % O₂, der optimalen Umgebung für die IVM-Kultur.

3. Vorbereitung der Ovarialrinde

HINWEIS: Die laparoskopische Entfernung des gesamten Eierstocks wurde wie von Jadoul et ^al.15 beschrieben durchgeführt.

1. Bei Ankunft des Eierstocks im Labor waschen Sie den Eierstock zweimal im OTC-Handhabungsmedium (Schritt 2.1), indem Sie den Eierstock mit dem OTC-Handhabungsmedium in eine 100-mm-Petrischale überführen.
2. Schneiden Sie den Eierstock mit einem Skalpell in Längsrichtung in zwei Hälften auf (Abbildung 1A).
3. Machen Sie mit einem frischen Skalpell mehrere Schnitte im Markgewebe, sowohl vertikal als auch horizontal. Vermeiden Sie es, den Kortex zu beschädigen. Durchstechen Sie die festen Antralfollikel unterschiedlicher Größe in der Medulla vorsichtig mit dem Skalpell, um die Follikelflüssigkeit im OTC-Handhabungsmedium freizusetzen.
4. Reduzieren Sie das weiche Markgewebe mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 1B). Dieser Vorgang kann einige Minuten dauern.
5. Legen Sie die Eierstockschale während des Trimmvorgangs in eine neue Schale mit frischem OTC-Handhabungsmedium.
6. Übertragen Sie die Schale mit den medullären Fragmenten und der freigesetzten Follikelflüssigkeit (Abbildung 1C) in den zweiten Durchflussschrank, um die Suche nach COCs zu starten.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 bis 3.6, bis die gewünschte Dicke (1-2 mm) des Rindengewebes erreicht ist.
8. Schneide die Hirnrinde in Stücke von ca. 8 mm x 5 mm.
9. Inkubieren Sie die Stücke 3x hintereinander für 10 min in ca. 25 mL OTC-Gefriermedium (Schritt 2.2) in 100 mm Petrischale.
10. Legen Sie ein Stück in 800 μl OTC-Gefriermedium in ein Kryofläschchen.
11. Kryokonservierung des Eierstockgewebes mit einem langsamen Einfrierprotokoll in einer Kryokammer, die von einem Temperaturregler gesteuert wird (siehe Materialtabelle): von 4 °C bis -7 °C bei -2 °C/min, manuelle Aussaat bei -7 °C, von -7 °C bis -40 °C bei -0,3 °C/min, von -40 °C bis -100 °C bei -10 °C/min, und bei -100 °C die Kryofläschchen in flüssigen Stickstoff tauchen und lagern.

4. Suche nach KOK

1. Bereiten Sie den Laminar-Flow-Schrank für die COC-Suche vor.
   1. Warme 60 mm Kulturschalen auf dem beheizten Tisch unter dem Stereomikroskop im Laminar-Flow-Schrank.
   2. Legen Sie die 14-ml-Röhrchen mit 6 mL vorgewärmtem Suchmedium (Schritt 2.3.1) in einen beheizten Block und die vorgewärmte 4-Well-Schale mit Suchmedium auf den beheizten Tisch unter dem Mikroskop in den Laminar-Flow-Schrank.
   3. Einen Sterilfilter (Zellsieb, 70 μm Maschenweite; siehe Materialtabelle) von unten nach unten in eine Kulturschale legen.
   4. Nehmen Sie eine 290-310 μm Glaskapillare zur Verwendung: Verwenden Sie keine kleineren Kapillaren als 290-310 μm, um eine Schädigung der Konnektivität zwischen Eizelle und Kumulus zu vermeiden.
   5. Stellen Sie sicher, dass 1 ml Filterspitzen und eine 1 ml Pipette verfügbar sind.
2. Nehmen Sie die erste Schale mit medullären Fragmenten aus dem OTC-Laminar-Flow-Schrank (4 °C) und stellen Sie die Schale so schnell wie möglich auf die beheizte Stufe (37 °C) in den IVM-Laminar-Flow-Schrank.
   HINWEIS: Die erste Schale mit medullären Fragmenten und Follikelflüssigkeit kann mit Blut aus blutgefüllten ovulierten Follikeln oder dem Gefäßsystem des Eierstocks selbst kontaminiert sein. Rote Blutkörperchen verwischen die klare Sicht und erschweren die Suche nach KOK. Das kontaminierte Medium muss entfernt werden, um die roten Blutkörperchen wegzuspülen (siehe Schritt 4.3).
3. Entfernen Sie die Kontamination der Blutzellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Pipettieren Sie 2 mL Suchmedium über die Filtermembran (70 μm Zellsieb), um die Membran zu befeuchten, und stellen Sie die Schale, in der das Medium aufgefangen wurde, auf den beheizten Tisch.
   2. Drehen Sie den Filter auf den Kopf und legen Sie ihn mit dem Griff gegen den Rand einer neuen Kulturschale, so dass eine Schräge mit dem Boden des Filters entsteht.
   3. Sammeln Sie blutkontaminiertes Medium zwischen den medullären Fragmenten mit einer 1-ml-Spitze und blasen Sie es vorsichtig über die Filtermembran (Abbildung 1D), um die im kontaminierten Medium vorhandenen KOK aufzufangen.
   4. Schritt 4.3.3 wiederholen, bis der größte Teil des blutkontaminierten Mediums entfernt ist.
   5. Gießen Sie sofort frisches Suchmedium über die medullären Fragmente, um das COC immer im Nährmedium zu halten.
   6. Spülen Sie die geneigte Filtermembran vorsichtig mit 2 ml Suchmedium aus, um rote Blutkörperchen auf der Filtermembran zu entfernen.
   7. Setzen Sie den Filter mit der Unterseite nach unten in eine neue Schale ein und gießen Sie 3-4 ml Suchmedium in den Filter, um das COC von der Filtermembran in das Medium auszustoßen, das die Schale füllt. Entfernen Sie den Filter. Um sicherzustellen, dass die Filtermembran nicht austrocknet (und eventuelle KOK, die noch nicht aus ihr ausgeschieden sind), tauchen Sie den Filter mit der Unterseite nach unten in die erste Schale, mit der der Filter zum ersten Mal benetzt wurde.
   8. Untersuchen Sie das ausgestoßene Medium sofort auf KOK durch Sichtprüfung unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von 10x-50x. Suchen Sie nach klaren durchscheinenden Eizellen mit einem Rand aus dunklen, kompakten, umgebenden Kumuluszellen (Abbildung 1E). Schwenken Sie das Medium in der Schale und untersuchen Sie das Medium erneut.
   9. Spülen Sie den Filter ein zweites Mal in einer neuen Schale aus und untersuchen Sie das ausgestoßene Medium auf KOK.
   10. Untersuchen Sie das Medium in der Schale, in die der Filter eingetaucht ist, auf die restlichen KOK.
   11. Übertragen Sie KOK mit einer Glaskapillare in die 4-Well-Schale, die das Suchmedium enthält (Abbildung 1E). Halten Sie das Geschirr immer auf der erhitzten Bühne.
4. Suchen Sie zwischen den Markfragmenten nach KOK, nachdem Sie die kontaminierenden Blutzellen aus der Schale mit medullären Fragmenten entfernt und die Schale mit klarem Suchmedium aufgefüllt haben. Bewegen Sie sich mit der Glaskapillare um die Markfragmente herum und schwenken Sie das Medium in der Schale, um KOK zu finden. Ziehen Sie große Markfragmente mit Tuberkulinnadeln auf einer 1-ml-Spritze auseinander, wenn der Verdacht auf das Vorhandensein einer Eizelle besteht.
5. Sammeln Sie alle intakten KOKs in der 4-Well-Schale mit Suchmedium.
   HINWEIS: Bei einem typischen OTC-Verfahren wird das Kortexgewebe mit drei aufeinanderfolgenden 100-mm-Schalen aus der Medulla entfernt, wobei die Eierstockschale in eine neue Schale mit frischem Medium verschoben wird und die Reste für die COC-Suche in den IVM-Fluss übertragen werden. Normalerweise erfordert nur das erste Gericht die Entnahme von Blutzellen; In der zweiten und dritten Schale sind weniger medulläre Fragmente vorhanden, und die COC-Suche wird direkt zwischen den Fragmenten und im Medium durchgeführt.

5. IVM der KOK

1. Spülen Sie die KOK in einem sauberen Brunnen mit Suchmedium ab.
2. Bringen Sie die voräquilibrierte IVM-Kulturschale (die 4-Well-Schale, die eine Vertiefung mit LAG-Medium und drei Vertiefungen mit IVM-Medium enthält) aus dem Inkubator auf die beheizte Stufe im IVM-Durchflussschrank.
3. Beschriften Sie die IVM-Kulturschale, die KOK enthält, mit Patienteninformationen.
4. Spülen Sie die KOK in LAG-Medium (2-3 s) und geben Sie sie in eine der drei Vertiefungen mit zugesetztem IVM-Medium. Kultivieren Sie die KOK in Gruppen von ca. 10 KOK pro Vertiefung. Lassen Sie nackte Eizellen - Eizellen ohne anhaftende Kumuluszellen - aus der Kultur aus, da bekannt ist, dass sie ihr Entwicklungspotenzial stark beeinträchtigt haben.
5. Stellen Sie die Schale 30 Stunden lang bei 37 °C, 6 % CO₂ und 20 % O₂ in einen Inkubator.

6. Umgang mit reifen Eizellen

1. Entfernen Sie die Eizellen von ihren umgebenden Kumuluszellen durch kurze Exposition gegenüber 80 IE Hyaluronidase (siehe Materialtabelle) und sanftes mechanisches Pipettieren nach 30 h IVM.
2. Identifizieren Sie reife Eizellen durch die Extrusion des ersten Polkörpers.
3. Vitrifizieren oder befruchten Sie die reifen Eizellen, je nach Vorliebe der Patientin.
   HINWEIS: Fällt die Reifekontrolle nach 30 h IVM außerhalb der akzeptablen Arbeitszeit, kann die IVM-Dauer auf 28 h verkürzt oder auf bis zu 42 h verlängert werden. Wenn nach 30 h nur wenige reife Eizellen gewonnen werden, können unreife Eizellen zusätzlich über Nacht in der ursprünglichen IVM-Vertiefung, frei von Kumuluszellen, kultiviert und am nächsten Morgen zur Vitrifikation oder intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) verwendet werden, wenn sie reif sind.

Ergebnisse

In den letzten zehn Jahren wurde 98 Patientinnen, die sich einer Oophorektomie oder Ovarialbiopsie wegen OTC unterzogen, auch eine OTO-IVM angeboten. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind eine Aktualisierung des klinischen Programms,^{wie es vor 7,13} veröffentlicht wurde. Unreife Eizellen, die während der Verarbeitung von Eierstockgewebe gewonnen wurden, wurden in vitro überwiegend 30 Stunden lang gereift. Aus praktisc...

Diskussion

Die Priorität des FP-Verfahrens besteht immer darin, die Ovarialrinde gemäß dem in der Klinik validierten Standard-Operationsprotokoll zu manipulieren und einzufrieren. Ein Nachteil von FP ist das Fehlen eines Standardprotokolls, das in der veröffentlichten Literatur zu OTC und OTO-IVM verfügbar ist. Es ist schwierig, die Effizienz und Validität der Techniken und Anpassungen zu beurteilen, da zwischen dem Einfrieren/Vitrifizieren und dem Auftauen/Erwärmen in einem klinischen Umfel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal