卵巣組織卵子-生殖能力保存のためのIn Vitro 成熟

要約

ここで紹介するのは、卵巣組織卵子-in vitro 成熟(OTO-IVM)であり、卵巣組織の凍結保存を必要とする患者に現実的な追加の生殖能力保存オプションを提供する医療支援医療(MAR)ラボ内のアクセス可能な技術です。

要約

成熟卵子ガラス化は、不妊のリスクがある女性の生殖能力を維持するための標準治療です。しかし、卵巣組織凍結保存(OTC)は、性腺毒性治療を緊急に開始する必要がある女性や思春期前の子供の生殖能力を維持するための唯一の選択肢です。凍結保存のための卵巣皮質の準備中に、髄質組織が除去されます。成長中の胞状卵胞は、卵巣の皮質-髄質界面の境界に存在し、この過程で壊れ、卵丘-卵母細胞複合体(COC)を放出します。中程度および断片化された髄質組織を徹底的に検査することにより、これらの未熟な卵丘-卵母細胞複合体をOTC手順を妨げることなく特定できます。卵巣組織由来の未熟卵子は、 in vitro でうまく成熟させることができ、生殖能力保存のための配偶子の追加供給源を作り出すことができます。OTCが医療生殖補助医療研究所内またはその近くで行われる場合、必要なすべての 体外 成熟(IVM)および卵子ガラス化ツールを手元に置くことができます。さらに、寛解と子供の希望に応じて、患者は生殖能力の回復のための複数の選択肢を持っています:卵巣組織移植またはガラス化/温められた卵子の授精後の胚移植。したがって、卵巣組織卵子-in vitro 成熟(OTO-IVM)は、貴重な補助的な受胎能保存技術になる可能性があります。

概要

性腺毒性治療、性転換療法、または早期卵巣不全の遺伝的素因を持つ女性に対する妊孕性温存(FP)の選択肢は、患者の健康状態と年齢、利用可能な時間枠、治療の種類、患者の好み、および選択した不妊治療センターで利用可能なFP手順によって異なります。ゴナドトロピンによる卵巣刺激後に得られる成熟卵子のガラス化と、医療補助医療(MAR)実験室サイクルでの卵子回収は、FP ^1,2の好ましい選択肢と考えられています。ただし、思春期前の少女、性腺毒性治療または性腺切除術の緊急開始が必要な女性、または性腺毒性治療による永久無月経のリスクが高い女性の場合、性腺刺激ホルモンによる卵巣刺激のサイクルは不可能であり、FP ^1,2 に受け入れられ有効な技術である卵巣組織凍結保存 (OTC)³ が唯一の選択肢です。OTCの目標は、卵巣皮質組織に何千もの休眠中の原始卵胞を凍結保存することであり、凍結/融解した組織を残りの卵巣に移植した後、または代表的な組織断片の微小残存病変を慎重にスクリーニングした後、腹膜ポケットで成長を再開することができます。

凍結保存に適した厚さ1〜2mmの皮質断片を得るためには、軟髄組織を除去する必要があります。この髄質組織は通常、発達のさまざまな段階で卵胞の成長を伴い、硬い卵巣皮質から逃れて成長と拡大を可能にします⁴。長年にわたり、いくつかの研究室が、in vitro成熟(IVM)^5,6,7(卵巣組織卵母細胞IVM(OTO-IVM)と呼ばれる)を使用して、卵巣皮質断片調製後に残存髄質組織に存在する卵胞から回収されたこれらの卵子の可能性を調査してきました。胞状卵胞は、直径が6mm未満のものであっても、IVM^{システム8,9}を使用して成熟し、受精し、健康な赤ちゃんに成長できる卵丘細胞に囲まれた未熟な卵子を含んでいます。IVMは、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)患者など、卵巣過剰刺激症候群(OHSS)のリスクがある女性に対する標準治療と考えられています。ただし、FPの分野では、卵巣刺激が禁忌の場合のIVMについて利用できるデータは限られています。経膣的に採取された卵子のIVMは依然として革新的であると考えられており、OTO-IVMは実験的であると考えられています^2,10。とは言うものの、OTO-IVM^11,12,13 後の最初の出生の報告は、患者の FP に OTC が必要な場合に OTO-IVM を追加技術として使用する可能性を強調しています¹⁴。

この研究では、MARラボでOTO-IVMを採用するための技術的な詳細を提供し、単一のセンターで得られた結果を示しています。

プロトコル

OTO-IVM に関する本研究は、UZ-Brussels の地元の倫理委員会によって承認されています (プロジェクト 2008/068 およびプロジェクト 2022/303 の補遺)。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントに署名しました。各患者は、生殖医療専門医、ナビゲーター看護師、および紹介腫瘍医によって個別に評価され、患者の好みを考慮して最適なFP治療計画が構成されました¹⁴。要するに、OTCの対象となる患者はFPを緊急に必要としており、¹⁴歳で36歳未満です。OTCとOTO-IVMを組み合わせるには、OTCの前の6か月間に化学療法または放射線療法を実施することはできません。

1. 研究室の環境と人員

1. クラスAの層流キャビネットでOTCを実行します。
2. 2人のオペレーターでOTCを実行します:1人はラミナルフローキャビネットで無菌的に作業し、もう1人は殺菌剤と殺胞子剤の除染スプレーですべての非滅菌材料を洗浄し、材料と供給を最初のオペレーターに無菌的に引き渡します。ベンチトップクーラーの蓋(± 4°C)で卵巣皮質を処理します。
3. MARラボの加熱ステージ(37°C)で、実体顕微鏡を使用して2番目の層流キャビネットでCumulus-卵母細胞複合体(COC)検索を実行します。
4. 髄質残骸からCOCを回収し(セクション3および4)、IVMプロセスを開始します(セクション5)。これは、3 番目のオペレーターによって行われます。

2. 培地の準備

注:この手順では、OTC取り扱い培地、OTC凍結培地、サーチ培地、LAG培地、IVM培地の5種類のメディアが使用されます(詳細は以下を参照)。メディアを準備するときは、セクション1で詳しく説明するように、フローキャビネットで無菌的に作業します。すべての手順で新しい未開封の試薬を使用し、生成された培地の無菌性を確認するために使用されるすべての使い捨ての無菌性を維持します。

1. OTCハンドリング媒体
   1. LeibovitzのL15培地に4 mg/mLのヒト血清アルブミン(HSA)、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンを添加します( 材料の表を参照)。
   2. OTC取り扱い培地は、使用するまで冷蔵保管してください(最大2日間)。
      注:OTC取り扱い培地を使用して卵巣組織をすすぎ、処理し、冷やして(0〜4°C)使用します。
2. OTC冷凍媒体
   1. LeibovitzのL15培地に1.5 Mジメチルスルホキシド(DMSO)と4 mg/mL HSAを添加します。
   2. OTC冷凍培地は、使用するまで冷蔵保管してください(最大2日間)。
3. 検索媒体
   注:サーチ培地(卵子処理用のHEPES緩衝培地)は市販されており( 材料表を参照)、すぐに使用できます。検索媒体を使用してフィルターをすすぎ、髄質断片の間のCOCを検索しながらCOCを収集します(セクション4)。
   1. 14 mL丸底滅菌チューブ6本に6 mLの検索培地を充填します。
   2. 500 μLのサーチ培地を350 μLのオイルで覆った4ウェルディッシュを調製します( 材料の表を参照)。
   3. 卵巣組織が到着する前に、チューブと4ウェルディッシュを37°Cで少なくとも1時間加熱します。HEPES緩衝培地は、_CO2 インキュベーションを必要としません。
4. LAGミディアム
   注:市販のIVMシステム( 材料の表を参照)は、LAG培地とIVM培地の2つの異なる媒体で構成されており、以下に詳述するように補足する必要があります。LAG培地はCOCをすすぐために使用されますが、IVMシステムの挿入によって示唆されるように、IVM培地でのIVMに先行する2〜3時間のインキュベーション期間にも使用できます。
   1. 市販のすぐに使用できるLAGメディウムを使用してください( 材料の表を参照)。
5. IVM媒体
   1. 市販のIVM培地に10 mg/mL HSA、75 mIU/mL卵胞刺激ホルモン(FSH)、および100 mIU/mLヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を補充します。
   2. 1ウェルのLAG培地と3ウェルの補充IVM培地(500 μLの培地に350 μLのオイルオーバーレイ)を入れた4ウェル培養皿を調製します。
   3. IVM培養に最適な環境である6%_CO2 および20%_O2のインキュベーターで、37°Cのインキュベーターで一晩皿を平衡化します。

3.卵巣皮質の準備

注:腹腔鏡下全卵巣摘出術は、Jadoul et ^al.15に記載されているように行われました。

1. 卵巣が実験室に到着したら、卵巣をOTC取り扱い培地と一緒に100mmのシャーレに移すことにより、OTC取り扱い培地で卵巣を2回洗浄します(ステップ2.1)。
2. メスで、卵巣を縦半分に切り開きます(図1A)。
3. 新鮮なメスで髄質組織に垂直と水平の両方にいくつかの切開を行います。皮質の損傷を避けてください。髄質内のさまざまなサイズの硬い胞状卵胞をメスで優しく突き刺し、OTC処理媒体の卵胞液を放出します。
4. 手術用ハサミで軟髄組織を切除します(図1B)。この手順には数分かかる場合があります。
5. トリミングプロセス中に、卵巣の殻を新しい皿に入れ、新鮮なOTC処理培地を入れます。
6. 髄質の破片と放出された卵胞液(図1C)が入った皿を2番目のフローキャビネットに移して、COCの検索を開始します。
7. 皮質組織の所望の厚さ(1〜2mm)が得られるまで、ステップ3.4〜3.6を繰り返します。
8. 皮質を約8 mm x 5 mmの小片にスライスします。
9. 100 mmシャーレ中の約25 mLのOTC凍結培地(ステップ2.2)で、ピースを3回連続して10分間インキュベートします。
10. 1ピースを800 μLのOTC凍結培地に1個入れます。
11. 温度コントローラーによって制御されるクライオチャンバー内で、ゆっくりと凍結するプロトコルを使用して卵巣組織を凍結保存 します：材料表を参照：4°Cから-7°Cまで-2°C/分で手動播種、-7°Cから-40°Cまで-0.3°C/分で-7°Cから-40°Cまで、-40°Cから-100°Cまで-10°C/分で播種、 -100°Cでクライオバイアルを液体窒素に浸し、保存します。

4. COCの検索

1. COC検索用の層流キャビネットを準備します。
   1. 層流キャビネット内の実体顕微鏡下の加熱ステージで60mmの培養皿を温めます。
   2. 6 mLの予熱されたサーチメディウム(ステップ2.3.1)を入れた14 mLチューブを加熱ブロックに入れ、サーチメディウムを入れた予熱した4ウェルディッシュを加熱ステージの熱したステージの層流キャビネット内の顕微鏡下に置きます。
   3. 滅菌フィルター(細胞ストレーナー、メッシュサイズ70 μm、 材料表を参照)を培養皿にボトムダウンで置きます。
   4. 290-310 μmのガラスキャピラリーを使用:卵母細胞と卵丘細胞の接続性への損傷を避けるために、290-310 μmより小さいキャピラリーを使用しないでください。
   5. 1 mLのフィルターチップと1 mLのピペットが用意されていることを確認してください。
2. OTC層流キャビネット(4°C)から髄質片を含む最初の皿を取り、できるだけ早くIVM層流キャビネットの加熱ステージ(37°C)に皿を置きます。
   注:髄質の破片と卵胞液の最初の皿は、血液で満たされた排卵卵胞または卵巣自体の血管系からの血液で汚染されている可能性があります。赤血球は鮮明な視界をぼやけさせ、COCの検索を複雑にします。赤血球を洗い流すには、汚染された培地を取り除く必要があります(ステップ4.3を参照)。
3. 以下の手順に従って、血球の汚染を取り除きます。
   1. Search medium 2 mLをフィルターメンブレン(70 μmセルストレーナー)上にピペットで移し、メンブレンを濡らし、培地を捕捉したディッシュを加熱ステージの脇に置きます。
   2. フィルターを逆さまにして、ハンドルを新しい培養皿の縁に当てて置き、フィルターの底に傾斜を作ります。
   3. 1 mLのチップを使用して髄質断片の間に血液汚染培地を採取し、フィルターメンブレン(図1D)に優しく吹き付けて、汚染された培地に存在するCOCを捕捉します。
   4. 血液で汚染された培地のほとんどが除去されるまで、手順4.3.3を繰り返します。
   5. 新しい検索培地をすぐに髄質断片に注ぎ、COCを常に培地に懸濁させてください。
   6. 傾斜したフィルターメンブレンを2mLのサーチメディウムでやさしくすすぎ、フィルターメンブレン上の赤血球を洗い流します。
   7. フィルターを下にして新しいディッシュに置き、3〜4 mLの検索培地をフィルターに注ぎ、COCをフィルターメンブレンから皿を満たす培地に排出します。フィルターを取り外します。フィルターメンブレンが乾燥しないように(および、まだフィルターから排出されていない可能性のあるCOC)、フィルターを初めて濡らすために使用した最初の皿にフィルターを下にして浸します。
   8. 排出された媒体のCOCを、10倍から50倍の倍率の実体顕微鏡による目視検査により、直ちに検査します。暗くてコンパクトな周囲の卵丘細胞の縁を持つ透明な半透明の卵母細胞を探します(図1E)。皿の中で培地を回し、培地を再度調べます。
   9. 新しい皿でフィルターをもう一度すすぎ、排出された媒体にCOCがないか調べます。
   10. フィルターが浸されている皿の中の媒体を調べて、残りのCOCを探します。
   11. ガラスキャピラリーでCOCをサーチ培地を含む4ウェルディッシュに移します(図1E)。お皿は常に加熱されたステージに置いてください。
4. 髄質の断片で皿から汚染された血球を取り除き、透明な探索媒体を皿に補充した後、髄質の断片の間でCOCを探します。ガラスキャピラリーを使用して髄質の破片の周りを移動し、皿の中で培地を渦巻かせてCOCを見つけます。卵子の存在が疑われる場合は、1mLシリンジでツベルクリン針で大きな髄質の断片を引き離します。.
5. 4ウェルディッシュ中の無傷のCOCをすべてサーチ培地で回収します。
   注:一般的なOTC手順では、皮質組織は3つの連続した100 mmディッシュを使用して髄質から縮小され、卵巣シェルは新鮮な培地で新しいディッシュに移動し、残りはCOC検索のためにIVMフローに移されます。通常、最初の皿だけが血球の除去を必要とします。2番目と3番目の皿では、髄質の断片が少なく、COC探索は断片間および培地で直接実行されます。

5. COCのIVM

1. COCをサーチメディウムで清潔なウェルですすいでください。
2. 事前に平衡化されたIVM培養ディッシュ(LAG培地1ウェルとIVM培地3ウェルを含む4ウェルディッシュ)をインキュベーターからIVMフローキャビネット内の加熱ステージに移動します。
3. COCを含むIVM培養皿に患者情報をラベル付けします。
4. COCをLAG培地(2〜3秒)ですすぎ、IVM培地を補充した3つのウェルのいずれかに置き換わります。COCをウェルあたり約10個のCOCのグループで培養します。裸の卵子(付着した卵丘細胞がない卵母細胞)は、発生能力が著しく損なわれていることが知られているため、培養から除外します。
5. ディッシュを37°C、6%CO₂、および20%_O2 のインキュベーターに30時間置きます。

6. 成熟卵子の取り扱い

1. 80 IUのヒアルロニダーゼに短時間曝露し( 材料表参照)、IVMの30時間後に穏やかな機械的ピペッティングを行うことにより、周囲の卵丘細胞の卵母細胞を剥離します。
2. 成熟卵子は、最初の極性体の押し出しによって同定されます。
3. 患者の好みに応じて、成熟した卵子をガラス化または授精します。
   注:IVMの30時間後の成熟チェックが許容労働時間外の場合、IVMの持続時間は28時間に短縮するか、最大42時間まで延長することができます。30時間後に数個の成熟卵子しか得られない場合は、未熟な卵子を元のIVMウェルで一晩追加培養し、卵丘細胞を含まず、成熟した翌朝にガラス化または細胞質内精子注入(ICSI)に使用できます。

結果

過去10年間で、OTCの卵巣摘出術または卵巣生検を受けた98人の患者にもOTO-IVMが提供されました。ここで紹介する結果は、^7,13より前に発表された臨床プログラムの更新版です。卵巣組織処理中に得られた未熟卵子は、主に30時間in vitroで成熟させました。しかし、実用的な理由や、28〜42時間の範囲で成熟が短いため、?...

ディスカッション

FP手順の優先事項は、常に、臨床で検証された標準的な操作プロトコルに従って卵巣皮質を操作および凍結することです。FPの欠点は、OTCおよびOTO-IVMに関する公開文献で利用可能な標準プロトコルがないことです。臨床現場では、凍結/ガラス化と融解/加温の間には大きな時間差があるため、技術と適応の効率と妥当性を評価することは困難です。OTCプロトコルに変?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal