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Method Article
ここで紹介するのは、卵巣組織卵子-in vitro 成熟(OTO-IVM)であり、卵巣組織の凍結保存を必要とする患者に現実的な追加の生殖能力保存オプションを提供する医療支援医療(MAR)ラボ内のアクセス可能な技術です。
成熟卵子ガラス化は、不妊のリスクがある女性の生殖能力を維持するための標準治療です。しかし、卵巣組織凍結保存(OTC)は、性腺毒性治療を緊急に開始する必要がある女性や思春期前の子供の生殖能力を維持するための唯一の選択肢です。凍結保存のための卵巣皮質の準備中に、髄質組織が除去されます。成長中の胞状卵胞は、卵巣の皮質-髄質界面の境界に存在し、この過程で壊れ、卵丘-卵母細胞複合体(COC)を放出します。中程度および断片化された髄質組織を徹底的に検査することにより、これらの未熟な卵丘-卵母細胞複合体をOTC手順を妨げることなく特定できます。卵巣組織由来の未熟卵子は、 in vitro でうまく成熟させることができ、生殖能力保存のための配偶子の追加供給源を作り出すことができます。OTCが医療生殖補助医療研究所内またはその近くで行われる場合、必要なすべての 体外 成熟(IVM)および卵子ガラス化ツールを手元に置くことができます。さらに、寛解と子供の希望に応じて、患者は生殖能力の回復のための複数の選択肢を持っています:卵巣組織移植またはガラス化/温められた卵子の授精後の胚移植。したがって、卵巣組織卵子-in vitro 成熟(OTO-IVM)は、貴重な補助的な受胎能保存技術になる可能性があります。
性腺毒性治療、性転換療法、または早期卵巣不全の遺伝的素因を持つ女性に対する妊孕性温存(FP)の選択肢は、患者の健康状態と年齢、利用可能な時間枠、治療の種類、患者の好み、および選択した不妊治療センターで利用可能なFP手順によって異なります。ゴナドトロピンによる卵巣刺激後に得られる成熟卵子のガラス化と、医療補助医療(MAR)実験室サイクルでの卵子回収は、FP 1,2の好ましい選択肢と考えられています。ただし、思春期前の少女、性腺毒性治療または性腺切除術の緊急開始が必要な女性、または性腺毒性治療による永久無月経のリスクが高い女性の場合、性腺刺激ホルモンによる卵巣刺激のサイクルは不可能であり、FP 1,2 に受け入れられ有効な技術である卵巣組織凍結保存 (OTC)3 が唯一の選択肢です。OTCの目標は、卵巣皮質組織に何千もの休眠中の原始卵胞を凍結保存することであり、凍結/融解した組織を残りの卵巣に移植した後、または代表的な組織断片の微小残存病変を慎重にスクリーニングした後、腹膜ポケットで成長を再開することができます。
凍結保存に適した厚さ1〜2mmの皮質断片を得るためには、軟髄組織を除去する必要があります。この髄質組織は通常、発達のさまざまな段階で卵胞の成長を伴い、硬い卵巣皮質から逃れて成長と拡大を可能にします4。長年にわたり、いくつかの研究室が、in vitro成熟(IVM)5,6,7(卵巣組織卵母細胞IVM(OTO-IVM)と呼ばれる)を使用して、卵巣皮質断片調製後に残存髄質組織に存在する卵胞から回収されたこれらの卵子の可能性を調査してきました。胞状卵胞は、直径が6mm未満のものであっても、IVMシステム8,9を使用して成熟し、受精し、健康な赤ちゃんに成長できる卵丘細胞に囲まれた未熟な卵子を含んでいます。IVMは、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)患者など、卵巣過剰刺激症候群(OHSS)のリスクがある女性に対する標準治療と考えられています。ただし、FPの分野では、卵巣刺激が禁忌の場合のIVMについて利用できるデータは限られています。経膣的に採取された卵子のIVMは依然として革新的であると考えられており、OTO-IVMは実験的であると考えられています2,10。とは言うものの、OTO-IVM11,12,13 後の最初の出生の報告は、患者の FP に OTC が必要な場合に OTO-IVM を追加技術として使用する可能性を強調しています14。
この研究では、MARラボでOTO-IVMを採用するための技術的な詳細を提供し、単一のセンターで得られた結果を示しています。
OTO-IVM に関する本研究は、UZ-Brussels の地元の倫理委員会によって承認されています (プロジェクト 2008/068 およびプロジェクト 2022/303 の補遺)。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントに署名しました。各患者は、生殖医療専門医、ナビゲーター看護師、および紹介腫瘍医によって個別に評価され、患者の好みを考慮して最適なFP治療計画が構成されました14。要するに、OTCの対象となる患者はFPを緊急に必要としており、14歳で36歳未満です。OTCとOTO-IVMを組み合わせるには、OTCの前の6か月間に化学療法または放射線療法を実施することはできません。
1. 研究室の環境と人員
2. 培地の準備
注:この手順では、OTC取り扱い培地、OTC凍結培地、サーチ培地、LAG培地、IVM培地の5種類のメディアが使用されます(詳細は以下を参照)。メディアを準備するときは、セクション1で詳しく説明するように、フローキャビネットで無菌的に作業します。すべての手順で新しい未開封の試薬を使用し、生成された培地の無菌性を確認するために使用されるすべての使い捨ての無菌性を維持します。
3.卵巣皮質の準備
注:腹腔鏡下全卵巣摘出術は、Jadoul et al.15に記載されているように行われました。
4. COCの検索
5. COCのIVM
6. 成熟卵子の取り扱い
過去10年間で、OTCの卵巣摘出術または卵巣生検を受けた98人の患者にもOTO-IVMが提供されました。ここで紹介する結果は、7,13より前に発表された臨床プログラムの更新版です。卵巣組織処理中に得られた未熟卵子は、主に30時間in vitroで成熟させました。しかし、実用的な理由や、28〜42時間の範囲で成熟が短いため、?...
FP手順の優先事項は、常に、臨床で検証された標準的な操作プロトコルに従って卵巣皮質を操作および凍結することです。FPの欠点は、OTCおよびOTO-IVMに関する公開文献で利用可能な標準プロトコルがないことです。臨床現場では、凍結/ガラス化と融解/加温の間には大きな時間差があるため、技術と適応の効率と妥当性を評価することは困難です。OTCプロトコルに変?...
著者らは、競合する金銭的利益を持っていません。
この研究は、ブリュッセルIVFのIVF研究所、ブリュッセルのVUBのZiekenhuis大学で行われました。著者は、MAR研究所内に不妊治療保存ユニットを設立するために必要な高いスキル、精度、柔軟性について、ブリュッセルIVF研究所のすべてのチームメンバーに感謝したいと思います。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1000 µL filter tips | Eppendorf/VWR International | 613-6780 | COC search |
Benchtop Cooler | Fisher Scientific | 15-350-54 | Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled |
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm | Corning/VWR International | 430591 | Dish for ovarian tissue preparation |
CryoSure-DMSO | WAK Chemicals | 0482 | Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation |
Cumulase | Origio/CooperSurgical | 16125000A | recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM |
Decontamination spray: Suprox | Medipure LTD | MP016 | Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action |
Disposable scalpels | Swann-Morton | 0511 | Ovarian tissue preparation |
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Falcon/VWR International | BDAA352057 | Medium container |
Falcon Cell strainer 70 µm | Falcon/VWR International | 352350 | Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search |
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller | Cryologic | CL-8800i CC60AS | Slow freezing machine |
FSH: Menopur 75 IU | Ferring | BE197504 | Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium |
Handling pipette 290-310 µm | Vitrolife | 15538 | COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity |
hCG: Brevactid 5000 IE | Ferring | 5008001036 | Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium |
High security tube | CryoBioSystem | 022252 | cryovial, heat-sealed for safe cryostorage |
HSA-solution | Vitrolife | 10064 | Human serum Albumin: supplement for IVM medium |
Leibovitz's L-15 medium | Life Technologies Europe | 31415-029 | Handling medium for ovarian tissue preparation |
MediCult IVM system | Origio/CooperSurgical | 82214010 | medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol |
METZENBAUM fino scissors 140 mm | Chirurgical Maintenance | VIZ08280314 | Medium size scissors for initial medulla removal |
Nunc 4-well dishes for IVF | Nunc/VWR International | 144444 | COC collection during COC search and IVM culture |
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile | Thermo Scientific/VWR | NUNC150270 | Dish for COC search |
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin | Origio/CooperSurgical | 10765060 | Search medium for COC search |
Ovoil | Vitrolife | 10029 | oil for IVM culture |
Penicillin/Streptomicin mix | Life Technologies Europe | 15140-148 | Supplement for OTC handling medium |
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade | Chirurgical Maintenance | VIREBST999-SC | Small size scissors for residual medulla removal |
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