난소 조직 난모세포-생식력 보존을 위한 체외 성숙

요약

여기에 제시된 것은 난소 조직 난모 세포 체외 성숙(OTO-IVM)으로, 난소 조직 동결 보존이 필요한 환자에게 현실적인 추가 가임력 보존 옵션을 제공하는 의료 보조 생식증식(MAR) 실험실에서 접근 가능한 기술입니다.

초록

성숙한 난모세포 유리화는 불임 위험이 있는 여성의 생식력을 보존하기 위한 표준 치료입니다. 그러나 난소 조직 동결 보존(OTC)은 긴급하게 성선 독성 치료를 시작해야 하는 여성이나 사춘기 이전 어린이의 생식력을 보존할 수 있는 유일한 옵션입니다. 동결 보존을 위한 난소 피질을 준비하는 동안 수질 조직이 제거됩니다. 성장하는 전방 여포는 난소의 피질-수질 계면의 경계에 위치하며 이 과정에서 파괴되어 적운-난모세포 복합체(COC)를 방출합니다. 배지 및 단편화된 수질 조직을 철저히 검사함으로써 이러한 미성숙 적운-난모 세포 복합체는 OTC 절차를 방해하지 않고 식별할 수 있습니다. 난소 조직에서 유래한 미성숙 난모세포는 체외에서 성공적으로 성숙할 수 있으며, 생 식력 보존을 위한 배우자의 추가 공급원을 생성할 수 있습니다. OTC가 의료 보조 생식 검사실 내부 또는 근처에서 수행되는 경우 필요한 모든 체외 성숙(IVM) 및 난모세포 유리화 도구를 사용할 수 있습니다. 또한, 차도와 아이의 소원에 따라 환자는 생식 회복을 위한 여러 가지 옵션을 가질 수 있습니다: 난소 조직 이식 또는 유리화/가온 난모세포 수정 후 배아 이식. 따라서 난소 조직 난모세포 체외 성숙(OTO-IVM)은 유용한 보조 생식력 보존 기술이 될 수 있습니다.

서문

성선 독성 치료, 성전환 치료를 계획한 여성 또는 조기 난소 부전의 유전적 소인이 있는 여성을 위한 가임력 보존(FP) 옵션은 환자의 건강 상태와 연령, 이용 가능한 기간, 치료 유형, 환자의 선호도 및 선택한 불임 센터에서 이용할 수 있는 FP 절차에 따라 다릅니다. 의료 보조 생식증식(MAR) 실험실 주기에서 성선 자극 및 난모세포 채취를 통한 난소 자극 후 얻은 성숙한 난모세포의 유리화는 FP ^1,2에 대해 선호되는 옵션으로 간주됩니다. 그러나 사춘기 이전 여아, 성선 독성 치료 또는 생식선 절제술의 긴급한 시작이 필요한 여성 또는 성선 독성 치료로 인해 영구적인 무월경 위험이 높은 여성의 경우 성선 자극 호르몬을 사용한 난소 자극 주기가 불가능하며 FP ^1,2에 대해 허용되고 유효한 기술인 난소 조직 동결 보존(OTC)이 불가능합니다^{. 3}이 유일한 옵션입니다. OTC의 목표는 난소 피질 조직에서 수천 개의 휴면 원시 여포를 동결 보존하는 것이며, 이는 대표적인 조직 단편에서 최소한의 잔류 질환을 주의 깊게 선별한 후 동결/해동된 조직을 나머지 난소 또는 복막 주머니에 이식한 후 성장을 재개할 수 있습니다.

동결 보존에 적합한 1-2mm 두께의 피질 조각을 얻으려면 부드러운 수질 조직을 제거해야 합니다. 이 수질 조직은 일반적으로 다양한 발달 단계에서 성장과 확장을 위해 뻣뻣한 난소 피질을 탈출하는 여포가 성장하는 것을 수반합니다⁴. 수년 동안 여러 실험실에서 난소 조직 난모세포 IVM(OTO-IVM)이라고 하는 체외 성숙(IVM)^5,6,7을 사용하여 난소 피질 절편 준비 후 난포 조직에 있는 난포에서 회수된 이러한 난모세포의 잠재력을 조사해 왔습니다. 직경이 6mm 미만인 전낭 난포(antral follicles)에는 IVM 시스템을 사용하여 성숙, 수정 및 건강한 아기로 발달할 수 있는 적운 세포로 둘러싸인 미성숙 난모세포가 포함되어 있습니다 ^8,9. IVM은 다낭성 난소 증후군(PCOS) 환자와 같은 난소 과자극 증후군(OHSS)의 위험이 있는 여성을 위한 표준 치료로 간주됩니다. 그러나 FP 분야에서는 난소 자극에 대한 금기 사항이 있는 경우 IVM에 사용할 수 있는 데이터가 제한적입니다. 질로 수집된 난모세포의 IVM은 여전히 혁신적인 것으로 간주되며, OTO-IVM은 실험적인 것으로 간주됩니다 ^2,10. 그렇긴 하지만, OTO-IVM^11,12,13 이후 첫 출산에 대한 보고는 환자¹⁴에서 FP에 OTC가 필요할 때 OTO-IVM을 추가 기술로 사용할 수 있는 가능성을 강조합니다.

이 연구는 MAR 실험실에서 OTO-IVM을 채택하기 위한 기술적 세부 사항을 제공하고 단일 센터에서 얻은 결과를 보여줍니다.

프로토콜

OTO-IVM에 대한 본 연구는 UZ-브뤼셀 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다(프로젝트 2008/068 및 프로젝트 2022/303 부록). 모든 환자는 서면 동의서에 서명했습니다. 환자의 선호도를 고려하여 최적의 FP 치료 계획을 수립하기 위해 생식의학 전문의, 내비게이터 간호사 및 담당 종양 전문의가 각 환자를 개별적으로 평가했다¹⁴. 요컨대, OTC에 적합한 환자는 FP가 긴급히 필요하며¹⁴세 미만인 36세 미만입니다. OTC와 OTO-IVM을 결합하기 위해서는 OTC 이전 6개월 동안 화학 요법 또는 방사선 요법을 시행할 수 없어야 합니다.

1. 실험실 환경 및 인력

1. 클래스 A 층류 캐비닛에서 OTC를 수행합니다.
2. 두 명의 작업자와 함께 OTC를 수행합니다: 한 명은 층류 캐비닛에서 무균 작업하고, 다른 한 명은 살균제 및 살포자 살균제 오염 제거 스프레이로 모든 비멸균 재료를 세척하고 첫 번째 작업자에게 무균 상태로 재료와 용품을 넘깁니다. 탁상용 쿨러 뚜껑(± 4°C)에서 난소 피질을 처리합니다.
3. 가열된 스테이지(37°C)에서 MAR 실험실의 실체현미경을 사용하여 두 번째 층류 캐비닛에서 적운-난모 세포 복합체(COC) 검색을 수행합니다.
4. 수질 잔해(섹션 3 및 4)에서 COC를 검색하고 IVM 프로세스(섹션 5)를 시작합니다. 이 작업은 세 번째 작업자가 수행합니다.

2. 배지 준비

참고: 이 절차에는 OTC 처리 매체, OTC 동결 매체, 검색 매체, LAG 매체 및 IVM 매체의 5가지 유형의 매체가 사용됩니다(아래 설명 참조). 매체를 준비할 때 섹션 1에 설명된 대로 흐름 캐비닛에서 무균 상태로 작업하십시오. 모든 절차에 대해 개봉되지 않은 새 시약을 사용하고 생산된 매체의 무균 상태를 확인하는 데 사용되는 모든 일회용품의 무균 상태를 유지합니다.

1. OTC 취급 매체
   1. Leibovitz의 L15 배지에 4mg/mL 인간 혈청 알부민(HSA), 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 보충합니다( 재료 표 참조).
   2. OTC 취급 매체는 사용할 때까지(최대 2일 동안) 냉장 보관하십시오.
      알림: OTC 취급 매체를 사용하여 난소 조직을 헹구고 가공하고 차갑게(0-4 °C) 사용하십시오.
2. OTC 냉동 매체
   1. Leibovitz의 L15 배지에 1.5M 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 4mg/mL HSA를 보충합니다.
   2. OTC 냉동 매체는 사용할 때까지(최대 2일 동안) 냉장 보관하십시오.
3. 검색 매체
   참고: 검색 배지(난모세포 처리를 위한 HEPES 완충 배지)는 상업적으로 이용 가능하며( 재료 표 참조) 바로 사용할 수 있습니다. 검색 매체를 사용하여 필터를 헹구고 COC를 수집하면서 수질 조각 사이에서 COC를 검색합니다(섹션 4).
   1. 6개의 14mL 둥근 바닥 멸균 튜브에 6mL의 검색 배지를 채웁니다.
   2. 350μL의 오일로 덮인 500μL의 검색 매체가 있는 4웰 접시를 준비합니다( 재료 표 참조).
   3. 난소 조직이 도착하기 전에 튜브와 4웰 접시를 37°C에서 최소 1시간 동안 가열합니다. HEPES 완충 배지는 CO₂ 배양이 필요하지 않습니다.
4. LAG 미디엄
   참고: 시중에서 판매되는 IVM 시스템( 재료 표 참조)은 LAG 매체와 IVM 매체의 두 가지 매체로 구성되며, 아래에 자세히 설명된 대로 보완해야 합니다. LAG 배지는 COC를 헹구는 데 사용되지만, IVM 시스템 삽입에서 제안한 바와 같이 IVM 배지에서 IVM이 발생하기 전에 2-3시간의 배양 기간 동안 사용할 수도 있습니다.
   1. 시중에서 판매되는 즉시 사용 가능한 LAG 매체를 사용합니다( 재료 표 참조).
5. IVM 미디엄
   1. 10mg/mL HSA, 75mIU/mL 난포 자극 호르몬(FSH) 및 100mIU/mL 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)으로 시판되는 IVM 배지를 보충합니다.
   2. LAG 배지 1웰과 보충된 IVM 배지 3웰이 있는 4웰 배양 접시를 준비합니다: 350μL의 오일 오버레이로 덮인 배지 500μL.
   3. IVM 배양을 위한 최적의 환경인 37°C의 인큐베이터에서 6% CO₂ 및 20% O₂로 하룻밤 동안 접시를 평형을 이룹니다.

3. 난소 피질 준비

참고: 복강경 전체 난소 제거는 Jadoul et ^al.15에 의해 기술된 대로 수행되었습니다.

1. 난소가 실험실에 도착하면 OTC 취급 매체를 사용하여 난소를 100mm 페트리 접시에 옮겨 OTC 취급 매체(2.1단계)에서 난소를 두 번 세척합니다.
2. 메스로 난소를 세로로 반으로 자릅니다(그림 1A).
3. 새 메스로 수직과 수평으로 수질 조직을 여러 번 절개합니다. 피질이 손상되지 않도록 한다. 메스로 수질 내 다양한 크기의 단단한 전방 여포를 부드럽게 뚫어 OTC 취급 매체의 여포액을 방출합니다.
4. 수술용 가위로 부드러운 수질 조직을 잘라냅니다(그림 1B). 이 절차는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
5. 트리밍 과정에서 새로운 OTC 처리 매체가 있는 새 접시에 난소 껍질을 넣습니다.
6. 수질 조각과 방출된 여포액(그림 1C)이 있는 접시를 두 번째 흐름 캐비닛으로 옮겨 COC 검색을 시작합니다.
7. 피질 조직의 원하는 두께(1-2mm)가 얻어질 때까지 3.4-3.6단계를 반복합니다.
8. 피질을 약 8mm x 5mm 크기로 자릅니다.
9. 100mm 페트리 접시에 약 25mL의 OTC 동결 매체(단계 2.2)에서 10분 동안 조각을 3회 연속으로 배양합니다.
10. 800μL의 OTC 동결 매체에 한 조각을 극저온에 넣습니다.
11. 온도 조절기로 제어되는 극저온 챔버에서 서서히 동결되는 프로토콜을 사용하여 난소 조직을 동결 보존합니다( 재료 표 참조): -2 °C/분에서 4 °C에서 -7 °C까지, -7 °C에서 수동 파종, -7°C에서 -40 °C까지 -0.3 °C/분, -40 °C에서 -100 °C까지 -10 °C/분, -100 °C에서 cryovials를 액체 질소에 담그고 보관하십시오.

4. COC 검색

1. COC 검색을 위해 층류 캐비닛을 준비합니다.
   1. 층류 캐비닛의 실체 현미경 아래 가열된 스테이지에서 60mm 배양 접시를 따뜻하게 합니다.
   2. 6mL의 예열된 Search medium(단계 2.3.1)이 있는 14mL 튜브를 가열된 블록에 넣고, Search medium이 있는 예열된 4웰 접시를 층류 캐비닛의 현미경 아래 가열된 스테이지에 놓습니다.
   3. 멸균 필터(셀 스트레이너, 70μm 메쉬 크기, 재료 표 참조)를 배양 접시에 아래에서 아래로 놓습니다.
   4. 290-310 μm 유리 모세관을 사용하여 사용: 난모세포-적운 세포 연결성의 손상을 방지하기 위해 290-310 μm보다 작은 모세관을 사용하지 마십시오.
   5. 1mL 필터 팁과 1mL 피펫을 사용할 수 있는지 확인합니다.
2. OTC 층류 캐비닛(4°C)에서 수질 조각이 있는 첫 번째 접시를 가져와서 가능한 한 빨리 IVM 층류 캐비닛의 가열된 단계(37°C)에 접시를 놓습니다.
   참고: 수질 조각과 여포액의 첫 번째 접시는 혈액으로 채워진 배란 난포 또는 난소 자체의 혈관 조직에서 나온 혈액으로 오염될 수 있습니다. 적혈구는 선명한 시력을 흐리게 하고 COC 검색을 복잡하게 만듭니다. 적혈구를 씻어내기 위해 오염된 매체를 제거해야 합니다(4.3단계 참조).
3. 아래 단계에 따라 혈액 세포 오염을 제거하십시오.
   1. 피펫 2mL의 서치 배지를 필터 멤브레인(70μm 세포 여과기) 위에 올려 멤브레인을 적시고 배지를 포집한 접시를 가열된 스테이지에 따로 둡니다.
   2. 필터를 거꾸로 뒤집고 손잡이로 새 배양 접시의 가장자리에 대고 필터 바닥과 함께 경사를 만듭니다.
   3. 1mL 팁을 사용하여 수질 절편 사이에 혈액에 오염된 배지를 수집하고 필터 멤브레인(그림 1D)에 부드럽게 불어 넣어 오염된 배지에 존재하는 COC를 포집합니다.
   4. 혈액에 오염된 매체가 대부분 제거될 때까지 4.3.3단계를 반복합니다.
   5. 수질 절편 위에 새로운 검색 배지를 즉시 부어 COC를 항상 배양 배지에 부유 상태로 유지합니다.
   6. 경사진 필터 멤브레인을 2mL의 서치 배지로 부드럽게 헹구어 필터 멤브레인의 적혈구를 헹굽니다.
   7. 필터를 새 접시에 아래에서 아래로 놓고 3-4mL의 검색 매체를 필터에 부어 COC를 필터 멤브레인에서 접시를 채우는 매체로 배출합니다. 필터를 제거합니다. 필터 멤브레인이 건조되지 않도록(그리고 아직 배출되지 않은 COC가 있을 수 있음) 필터를 처음 적시는 데 사용한 첫 번째 접시에 필터를 아래에서 아래로 담그십시오.
   8. 즉시 10x-50x 배율의 실체 현미경으로 육안 검사를 통해 COC에 대해 배출된 매체를 검사합니다. 어둡고 조밀한 주변 적운 세포의 테두리가 있는 투명한 반투명 난모세포를 검색합니다(그림 1E). 접시에서 매체를 휘젓고 매체를 다시 검사하십시오.
   9. 새 접시에서 필터를 두 번 헹구고 배출된 매체에서 COC를 검사합니다.
   10. 필터가 잠긴 접시의 매체에서 나머지 COC를 검사합니다.
   11. 유리 모세관이 있는 COC를 검색 매체가 포함된 4웰 접시로 옮깁니다(그림 1E). 접시를 항상 가열된 무대에 두십시오.
4. 수질 조각으로 접시에서 오염된 혈액 세포를 제거하고 투명한 검색 배지로 접시를 보충한 후 수질 조각 사이에서 COC를 검색합니다. 유리 모세관을 사용하여 수질 조각 주위를 이동하고 접시에서 배지를 소용돌이쳐 COC를 찾습니다. 난모세포의 존재가 의심되는 경우 1mL 주사기에 투베르쿨린 바늘로 큰 수질 조각을 분리하십시오.
5. 검색 매체를 사용하여 4웰 접시에 있는 모든 온전한 COC를 수집합니다.
   참고: 일반적인 OTC 절차에서 피질 조직은 3개의 연속 100mm 접시를 사용하여 수질에서 잘라내고, 여기서 난소 껍질은 새로운 배지가 있는 새 접시로 이동하고 잔여물은 COC 검색을 위해 IVM 흐름으로 전달됩니다. 일반적으로 첫 번째 요리만 혈액 세포를 제거해야 합니다. 두 번째 및 세 번째 접시에서는 더 적은 수질 조각이 존재하며 COC 검색은 조각 사이 및 배지에서 직접 수행됩니다.

5. COC의 IVM

1. 검색 매체를 사용하여 깨끗한 우물에서 COC를 헹굽니다.
2. 사전 평형화된 IVM 배양 접시(LAG 배지 1웰과 IVM 배지 3웰을 포함하는 4웰 접시)를 인큐베이터에서 IVM 흐름 캐비닛의 가열된 스테이지로 이동합니다.
3. COC가 포함된 IVM 배양 접시에 환자 정보를 표시합니다.
4. COC를 LAG 배지(2-3초)로 헹구고 IVM 배지가 보충된 3개의 웰 중 하나에 넣습니다. 웰당 약 10개의 COC 그룹으로 COC를 배양합니다. 부착 된 적운 세포가없는 난모 세포는 발달 잠재력이 심각하게 손상된 것으로 알려져 있으므로 배양에서 생략하십시오.
5. 접시를 37 ° C, 6 % CO₂ 및 20 % O₂ 의 인큐베이터에 30 시간 동안 놓습니다.

6. 성숙한 난모세포 처리

1. 80IU의 히알루로니다아제( 재료 표 참조)에 잠시 노출되고 IVM 30시간 후 부드러운 기계적 피펫팅을 통해 주변 적운 세포의 난모세포를 제거합니다.
2. 첫 번째 극체의 돌출에 의해 성숙한 난모세포를 식별합니다.
3. 환자의 선호도에 따라 성숙한 난모세포를 유리화하거나 수정하십시오.
   참고: IVM 30시간 이후의 숙성 점검이 허용 가능한 근무 시간을 벗어나는 경우 IVM 지속 시간을 28시간으로 단축하거나 최대 42시간까지 연장할 수 있습니다. 30시간 후에 몇 개의 성숙한 난모세포만 얻어진 경우, 미성숙 난모세포는 적운 세포가 없는 원래의 IVM 웰에서 하룻밤 동안 추가로 배양할 수 있으며, 성숙하면 다음날 아침 유리화(vitrification) 또는 세포질 내 정자 주입(ICSI)에 사용할 수 있습니다.

결과

지난 10년 동안 OTC에 대한 난소 절제술 또는 난소 생검을 받은 98명의 환자에게도 OTO-IVM이 제공되었습니다. 여기에 제시된 결과는 ^7,13 이전에 발표된 임상 프로그램의 업데이트입니다. 난소 조직 처리 중에 얻은 미성숙 난모세포는 주로 30시간 동안 시험관 내에서 성숙되었습니다. 그러나 실용적인 이유 또는 28-42시간 범위...

토론

FP 절차의 우선 순위는 항상 클리닉에서 검증된 표준 운영 프로토콜에 따라 난소 피질을 조작하고 동결하는 것입니다. FP의 단점은 OTC 및 OTO-IVM에 관해 발표된 문헌에서 사용할 수 있는 표준 프로토콜이 없다는 것입니다. 임상 환경에서 동결/유리화와 해동/가온 사이에 큰 시간 차이가 있기 때문에 기술 및 적응의 효율성과 타당성을 평가하기 어렵습니다. OTO-IVM의 효율성을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal