Maduración in vitro de ovocitos de tejido ovárico para la preservación de la fertilidad

Resumen

Aquí se presenta la maduración in vitro de ovocitos de tejido ovárico (OTO-IVM), una técnica accesible dentro de un laboratorio de reproducción médica asistida (MAR) que ofrece opciones adicionales realistas de preservación de la fertilidad a pacientes que necesitan criopreservación de tejido ovárico.

Resumen

La vitrificación de ovocitos maduros es el estándar de atención para preservar la fertilidad en mujeres con riesgo de infertilidad. Sin embargo, la criopreservación de tejido ovárico (OTC) sigue siendo la única opción para preservar la fertilidad en mujeres que necesitan iniciar un tratamiento gonadotóxico de forma urgente o en niños prepúberes. Durante la preparación de la corteza ovárica para la criopreservación, se extrae el tejido medular. Los folículos antrales en crecimiento residen en el borde de la interfaz corteza-medular del ovario y se rompen durante este proceso, liberando su complejo cúmulo-ovocito (COC). Al inspeccionar minuciosamente el medio y el tejido medular fragmentado, estos complejos cúmulo-ovocito inmaduros se pueden identificar sin interferir con el procedimiento de venta libre. Los ovocitos inmaduros derivados del tejido ovárico pueden madurar con éxito in vitro, creando una fuente adicional de gametos para la preservación de la fertilidad. Si la OTC se realiza dentro o cerca de un laboratorio médico de reproducción asistida, se puede tener a mano todas las herramientas necesarias de maduración in vitro (IVM) y vitrificación de ovocitos. Además, en caso de remisión y deseo del hijo, la paciente tiene múltiples opciones para la restauración de la fertilidad: trasplante de tejido ovárico o transferencia embrionaria tras la inseminación de ovocitos vitrificados/calentados. Por lo tanto, la maduración in vitro de ovocitos de tejido ovárico (OTO-IVM) puede ser una valiosa técnica complementaria de preservación de la fertilidad.

Introducción

Las opciones de preservación de la fertilidad (PF, por sus siglas en inglés) para las mujeres que planean un tratamiento gonadotóxico, terapia de reasignación de sexo o mujeres que tienen una predisposición genética a la insuficiencia ovárica prematura, dependen de la salud y la edad de la paciente, el período de tiempo disponible, el tipo de tratamiento, la preferencia de la paciente y los procedimientos de PF disponibles en el centro de fertilidad de elección. La vitrificación de ovocitos maduros obtenidos tras la estimulación ovárica con gonadotropinas y la extracción de ovocitos en un ciclo de laboratorio de reproducción médica asistida (RAE) se considera la opción preferida para la PF ^1,2. Sin embargo, para las niñas prepúberes, las mujeres en las que se requiere el inicio urgente de un tratamiento gonadotóxico o gonadectomía, o mujeres con un alto riesgo de amenorrea permanente debido al tratamiento gonadotóxico, no es posible un ciclo de estimulación ovárica con gonadotropinas, y la criopreservación de tejido ovárico (OTC), que es una técnica aceptada y válida para la PF ^{1,2, 3}, es la única opción. El objetivo de la OTC es criopreservar miles de folículos primordiales inactivos en el tejido de la corteza ovárica, que pueden reanudar el crecimiento después del trasplante de tejido congelado/descongelado en el ovario restante o en una bolsa peritoneal después de la detección cuidadosa de la enfermedad residual mínima en fragmentos de tejido representativos.

Para obtener fragmentos corticales de 1-2 mm de espesor adecuados para la criopreservación, es necesario extraer el tejido medular blando. Este tejido medular generalmente implica el crecimiento de folículos en varias etapas de desarrollo que escapan de la corteza ovárica rígida para permitir su crecimiento^{y expansión.} Durante muchos años, varios laboratorios han estado investigando el potencial de estos ovocitos recuperados de los folículos que residen en el tejido medular remanente después de la preparación de fragmentos corticales ováricos mediante maduración in vitro (IVM)^5,6,7, denominada IVM DE OVOCITOS DE TEJIDO OVÁRICO (OTO-IVM). Los folículos antrales, incluso los de menos de 6 mm de diámetro, contienen ovocitos inmaduros rodeados de cúmulos de células que pueden madurar, fertilizar y convertirse en bebés sanos utilizando un sistema IVM ^8,9. La MIV se considera el estándar de atención para las mujeres con riesgo de síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO), como las pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP). Sin embargo, en el campo de la PF, los datos disponibles para la MIV son limitados en casos con contraindicación para la estimulación ovárica; La MIV de ovocitos recolectados por vía transvaginal todavía se considera innovadora, y la MVO-OTO se considera experimental ^2,10. Dicho esto, los relatos de los primeros nacidos vivos después de la OTO-IVM^11,12,13 ponen de manifiesto el potencial del uso de la OTO-IVM como técnica complementaria cuando se requiere OTC para la PF en pacientes¹⁴.

Este estudio proporciona detalles técnicos para adoptar OTO-IVM en el laboratorio de MAR e ilustra los resultados obtenidos en un solo centro.

Protocolo

El presente estudio sobre OTO-IVM ha sido aprobado por el Comité de Ética local de UZ-Bruselas (adenda del proyecto 2008/068 y del proyecto 2022/303). Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado por escrito. Cada paciente fue evaluado individualmente por un médico especialista en medicina reproductiva, una enfermera orientadora y el oncólogo de referencia para componer el plan de tratamiento óptimo de PF, teniendo en cuenta las preferencias del paciente¹⁴. En resumen, los pacientes elegibles para OTC necesitan urgentemente PF y tienen menos de 36 años de edad¹⁴. Para combinar OTC con OTO-IVM, no se puede haber administrado quimioterapia o radioterapia en los 6 meses anteriores a la OTC.

1. Entorno y personal del laboratorio

1. Realice OTC en una cabina de flujo laminar de clase A.
2. Realice OTC con dos operadores: uno que trabaje asépticamente en la cabina de flujo laminar y un segundo que limpie todos los materiales no estériles con un spray descontaminante bactericida y esporicida y que entregue los materiales y suministros asépticamente al primer operador. Procese la corteza ovárica en una tapa de sobremesa (± 4 °C).
3. Realizar la búsqueda del complejo cúmulo-ovocito (COC) en una segunda cabina de flujo laminar con un microscopio estereoscópico en un laboratorio MAR en una platina calentada (37 °C).
4. Realizar la recuperación del COC de los restos medulares (secciones 3 y 4) e iniciar el proceso de MIV (sección 5). Esto lo hace un tercer operador.

2. Preparación de los medios de comunicación

NOTA: Se utilizan cinco tipos de medios para este procedimiento (detallados a continuación): medio de manipulación OTC, medio de congelación OTC, medio de búsqueda, medio LAG y medio IVM. Al preparar los medios, trabaje asépticamente en el gabinete de flujo, como se detalla en la sección 1. Utilice reactivos nuevos sin abrir para cada procedimiento y mantenga la esterilidad de todos los desechables utilizados para determinar la esterilidad de los medios producidos.

1. Medio de manipulación OTC
   1. Complemente el medio L15 de Leibovitz con 4 mg/mL de albúmina sérica humana (HSA), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (ver Tabla de Materiales).
   2. Mantenga el medio de manipulación de venta libre refrigerado hasta su uso (durante un máximo de 2 días).
      NOTA: Utilice un medio de manipulación de venta libre para enjuagar y procesar el tejido ovárico y utilícelo en frío (0-4 °C).
2. Medio de congelación OTC
   1. Complemente el medio L15 de Leibovitz con 1,5 M de dimetilsulfóxido (DMSO) y 4 mg/mL de HSA.
   2. Mantenga el medio de congelación OTC refrigerado hasta su uso (durante un máximo de 2 días).
3. Medio de búsqueda
   NOTA: El medio de búsqueda (un medio tamponado con HEPES para el manejo de ovocitos) está disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) y listo para usar. Utilice el medio de búsqueda para enjuagar el filtro y recoger el AOC mientras busca AOC entre los fragmentos de médula (sección 4).
   1. Llene seis tubos estériles de fondo redondo de 14 mL con 6 mL de medio de búsqueda.
   2. Prepare un plato de 4 pocillos con 500 μL de medio de búsqueda cubierto con 350 μL de aceite (ver Tabla de Materiales).
   3. Calentar las trompas y la placa de 4 pocillos a 37 °C durante al menos 1 h antes de la llegada del tejido ovárico. Los medios tamponados con HEPES no requieren incubación de CO₂ .
4. LAG medio
   NOTA: El sistema IVM disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) comprende dos medios diferentes: medio LAG y medio IVM, que deben complementarse como se detalla a continuación. El medio LAG se utiliza para enjuagar los AOC, pero también se puede utilizar durante un período de incubación de 2-3 h antes de la IVM en el medio IVM, como sugiere el inserto del sistema IVM.
   1. Utilice el medio LAG disponible en el mercado y listo para usar (véase la tabla de materiales).
5. IVM medio
   1. Complemente el medio IVM disponible comercialmente con 10 mg/mL de HSA, 75 mUI/mL de hormona foliculoestimulante (FSH) y 100 mUI/mL de gonadotropina coriónica humana (hCG).
   2. Prepare una placa de cultivo de 4 pocillos con un pocillo de medio LAG y tres pocillos de medio IVM suplementado: 500 μL de medio cubierto con 350 μL de recubrimiento de aceite.
   3. Equilibrar la placa durante la noche en una incubadora a 37 °C con un 6% de CO₂ y un 20% de_O2, el entorno óptimo para el cultivo de IVM.

3. Preparación de la corteza ovárica

NOTA: La extirpación laparoscópica de ovario completo se realizó según lo descrito por Jadoul et ^al.15.

1. A la llegada del ovario al laboratorio, lave el ovario en el medio de manipulación de venta libre (paso 2.1) dos veces transfiriendo el ovario a una placa de Petri de 100 mm con el medio de manipulación de venta libre.
2. Con un bisturí, corte el ovario por la mitad longitudinalmente (Figura 1A).
3. Realizar varias incisiones en el tejido medular tanto vertical como horizontalmente con un bisturí nuevo. Evita dañar la corteza. Perfore suavemente los folículos antrales firmes de varios tamaños dentro de la médula con el bisturí para liberar el líquido folicular en el medio de manipulación de venta libre.
4. Cortar el tejido blando de la médula con unas tijeras quirúrgicas (Figura 1B). Este procedimiento puede tardar varios minutos.
5. Coloque la cáscara ovárica en un plato nuevo con medio de manipulación fresco de venta libre durante el proceso de recorte.
6. Transfiera la placa con fragmentos medulares y líquido folicular liberado (Figura 1C) a la segunda cabina de flujo para iniciar la búsqueda de AOC.
7. Repita los pasos 3.4 a 3.6 hasta obtener el grosor deseado (1-2 mm) del tejido de la corteza.
8. Corta la corteza en trozos de aproximadamente 8 mm x 5 mm.
9. Incubar las piezas 3 veces consecutivas durante 10 min en aproximadamente 25 mL de medio de congelación OTC (paso 2.2) en placas de Petri de 100 mm.
10. Coloque una pieza en 800 μL de medio de congelación OTC en un criovial.
11. Criopreservar el tejido ovárico mediante un protocolo de congelación lenta en una criocámara controlada por un controlador de temperatura (ver tabla de materiales): de 4 °C a -7 °C a -2 °C/min, siembra manual a -7 °C, de -7 °C a -40 °C a -0,3 °C/min, de -40 °C a -100 °C a -10 °C/min, y a -100 °C sumergir los crioviales en nitrógeno líquido y almacenarlos.

4. Búsqueda de COC

1. Prepare la cabina de flujo laminar para la búsqueda de COC.
   1. Placas de cultivo calientes de 60 mm en la platina calentada bajo el microscopio estereoscópico en la cabina de flujo laminar.
   2. Coloque los tubos de 14 mL con 6 mL de medio de búsqueda precalentado (paso 2.3.1) en un bloque calentado, y la placa de 4 pocillos precalentada con medio de búsqueda en la platina calentada bajo el microscopio en la cabina de flujo laminar.
   3. Coloque un filtro estéril (colador de células, tamaño de malla de 70 μm; consulte la Tabla de materiales) de abajo hacia abajo en una placa de cultivo.
   4. Tome un capilar de vidrio de 290-310 μm para su uso: no use capilares más pequeños que 290-310 μm, para evitar daños en la conectividad entre el ovocito y la célula del cúmulo.
   5. Asegúrese de que haya disponibles puntas de filtro de 1 mL y una pipeta de 1 mL.
2. Tome la primera placa con fragmentos medulares de la cabina de flujo laminar OTC (4 °C) y coloque la placa en la etapa calentada (37 °C) en la cabina de flujo laminar IVM lo antes posible.
   NOTA: La primera placa de fragmentos medulares y líquido folicular puede estar contaminada con sangre de folículos ovulados llenos de sangre o de la propia vasculatura del ovario. Los glóbulos rojos nublan la visión clara y complican la búsqueda de AOC. El medio contaminado debe eliminarse para lavar los glóbulos rojos (ver paso 4.3).
3. Elimine la contaminación de las células sanguíneas siguiendo los pasos a continuación.
   1. Pipetear 2 mL de medio de búsqueda sobre la membrana del filtro (filtro de células de 70 μm) para humedecer la membrana y dejar la placa que capturó el medio a un lado en la etapa calentada.
   2. Dale la vuelta al filtro y colócalo con el mango contra el borde de una nueva placa de cultivo, creando una pendiente con la parte inferior del filtro.
   3. Recoja el medio contaminado con sangre entre los fragmentos medulares con una punta de 1 ml y sople suavemente sobre la membrana del filtro (Figura 1D) para capturar los AOC presentes en el medio contaminado.
   4. Repita el paso 4.3.3 hasta eliminar la mayor parte del medio contaminado con sangre.
   5. Vierta el medio de búsqueda fresco sobre los fragmentos medulares inmediatamente para mantener el COC suspendido en el medio de cultivo en todo momento.
   6. Enjuague suavemente la membrana del filtro inclinado con 2 ml de medio de búsqueda para enjuagar los glóbulos rojos de la membrana del filtro.
   7. Coloque el filtro de abajo hacia abajo en un plato nuevo y vierta 3-4 ml de medio Search en el filtro para expulsar el COC de la membrana del filtro al medio que llena el plato. Retire el filtro. Para asegurarse de que la membrana del filtro no se seque (y los posibles COC que aún no han sido expulsados de ella), sumerja el filtro de abajo hacia abajo en el primer plato, que se utilizó para humedecer el filtro por primera vez.
   8. Examine inmediatamente el medio expulsado en busca de AOC mediante inspección visual bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10x-50x. Búsqueda de ovocitos transparentes y translúcidos con un borde de cúmulos oscuros y compactos circundantes (Figura 1E). Agite el medio en el plato y vuelva a examinarlo.
   9. Enjuague el filtro por segunda vez en un plato nuevo y examine el medio expulsado en busca de AOC.
   10. Examine el medio en el plato donde está sumergido el filtro para los COC restantes.
   11. Transfiera los AOC con un capilar de vidrio a la placa de 4 pocillos que contiene el medio de búsqueda (Figura 1E). Mantenga los platos en el escenario calentado en todo momento.
4. Busque entre los fragmentos medulares COC después de eliminar las células sanguíneas contaminantes de la placa con fragmentos medulares y reponer la placa con un medio de búsqueda transparente. Utilice el capilar de vidrio para moverse alrededor de los fragmentos medulares y agitar el medio en el plato para encontrar AOC. Separe los fragmentos medulares grandes con agujas de tuberculina en una jeringa de 1 ml si se sospecha la presencia de un ovocito.
5. Recoja todos los AOC intactos en el plato de 4 pocillos con medio de búsqueda.
   NOTA: En un procedimiento típico de venta libre, el tejido de la corteza se corta desde la médula utilizando tres placas consecutivas de 100 mm, donde la cáscara ovárica se mueve a una nueva placa con medio fresco y donde los restos se transfieren al flujo de IVM para la búsqueda de AOC. Por lo general, solo el primer plato requiere la extracción de células sanguíneas; en la segunda y tercera placa, hay menos fragmentos medulares, y la búsqueda de COC se realiza directamente entre fragmentos y en el medio.

5. IVM de los AOC

1. Enjuague los AOC en un pozo limpio con medio de búsqueda.
2. Mueva la placa de cultivo de IVM preequilibrada (la placa de 4 pocillos que contiene un pocillo de medio LAG y tres pocillos de medio IVM) de la incubadora a la etapa calentada en el gabinete de flujo de IVM.
3. Etiquete la placa de cultivo de IVM que contiene AOC con información del paciente.
4. Enjuague los AOC en medio LAG (2-3 s) y colóquelos en uno de los tres pocillos con medio IVM suplementado. Cultive los AOC en grupos de aproximadamente 10 COC por pocillo. Omita los ovocitos desnudos (ovocitos desprovistos de células cúmulos adheridas) del cultivo, ya que se sabe que tienen un potencial de desarrollo gravemente comprometido.
5. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C, 6% de CO₂ y 20% de O₂ durante 30 h.

6. Manejo de ovocitos maduros

1. Separar a los ovocitos de sus cúmulos circundantes mediante una breve exposición a 80 UI de hialuronidasa (ver Tabla de materiales) y un pipeteo mecánico suave después de 30 h de IVM.
2. Identificar los ovocitos maduros por la extrusión del primer cuerpo polar.
3. Vitrificar o inseminar los ovocitos maduros, según la preferencia de la paciente.
   NOTA: Si el control de maduración después de 30 h de IVM cae fuera de las horas de trabajo aceptables, la duración de IVM puede acortarse a 28 h o extenderse hasta 42 h. Si solo se obtienen unos pocos ovocitos maduros después de 30 h, los ovocitos inmaduros se pueden cultivar adicionalmente durante la noche en el pozo IVM original, desprovisto de células cúmulos, y usarse a la mañana siguiente para la vitrificación o la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) cuando estén maduros.

Resultados

Durante la última década, a 98 pacientes sometidas a ooforectomía o biopsia ovárica de venta libre también se les ofreció OTO-IVM. Los resultados que aquí se presentan son una actualización del programa clínico publicado antes de ^7,13. Los ovocitos inmaduros obtenidos durante el procesamiento del tejido ovárico se maduraron in vitro predominantemente durante 30 h. Sin embargo, se permitió un tiempo de maduraci...

Discusión

La prioridad del procedimiento de PF es siempre manipular y congelar la corteza ovárica de acuerdo con el protocolo operativo estándar que ha sido validado en la clínica. Un inconveniente de la PF es la ausencia de un protocolo estándar disponible en la literatura publicada sobre OTC y OTO-IVM. Es difícil evaluar la eficiencia y la validez de las técnicas y adaptaciones, ya que existe un gran intervalo de tiempo entre la congelación/vitrificación y la descongelación/calentamient...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal