Maturazione in vitro di ovociti di tessuto ovarico per la preservazione della fertilità

Riepilogo

Qui viene presentata la maturazione in vitro di ovociti di tessuto ovarico (OTO-IVM), una tecnica accessibile all'interno di un laboratorio di riproduzione medicalmente assistita (MAR) che offre opzioni di conservazione della fertilità aggiuntive realistiche alle pazienti che necessitano di crioconservazione del tessuto ovarico.

Abstract

La vitrificazione di ovociti maturi è lo standard di cura per preservare la fertilità nelle donne a rischio di infertilità. Tuttavia, la crioconservazione del tessuto ovarico (OTC) è ancora l'unica opzione per preservare la fertilità nelle donne che devono iniziare urgentemente un trattamento gonadotossico o nei bambini in età prepuberale. Durante la preparazione della corteccia ovarica per la crioconservazione, il tessuto midollare viene rimosso. I follicoli antrali in crescita risiedono al confine dell'interfaccia corteccia-midollare dell'ovaio e si rompono durante questo processo, rilasciando il loro complesso cumulo-ovocita (COC). Ispezionando accuratamente il tessuto midollare medio e frammentato, questi complessi cumuli-ovociti immaturi possono essere identificati senza interferire con la procedura OTC. Gli ovociti immaturi derivati dal tessuto ovarico possono essere maturati con successo in vitro, creando un'ulteriore fonte di gameti per la conservazione della fertilità. Se l'OTC viene eseguita all'interno o vicino a un laboratorio di riproduzione medicalmente assistita, tutti gli strumenti necessari per la maturazione in vitro (IVM) e la vitrificazione degli ovociti possono essere a portata di mano. Inoltre, in caso di remissione e di desiderio del bambino, la paziente ha diverse opzioni per il ripristino della fertilità: trapianto di tessuto ovarico o trasferimento di embrioni dopo l'inseminazione di ovociti vitrificati/riscaldati. Pertanto, la maturazione in vitro degli ovociti nel tessuto ovarico (OTO-IVM) può essere una preziosa tecnica aggiuntiva di conservazione della fertilità.

Introduzione

Le opzioni di conservazione della fertilità (FP) per le donne pianificate per il trattamento gonadotossico, la terapia di riassegnazione del sesso o le donne che hanno una predisposizione genetica per l'insufficienza ovarica prematura, dipendono dalla salute e dall'età della paziente, dal periodo di tempo disponibile, dal tipo di trattamento, dalle preferenze del paziente e dalle procedure di FP disponibili presso il centro di fertilità di scelta. La vitrificazione di ovociti maturi ottenuta dopo la stimolazione ovarica con gonadotropine e il prelievo di ovociti in un ciclo di laboratorio di riproduzione medicalmente assistita (MAR) è considerata l'opzione preferita per FP ^1,2. Tuttavia, per le ragazze in età prepuberale, le donne in cui è richiesto l'inizio urgente del trattamento gonadotossico o della gonadectomia, o le donne con un alto rischio di amenorrea permanente a causa del trattamento gonadotossico, non è possibile un ciclo di stimolazione ovarica con gonadotropine e la crioconservazione del tessuto ovarico (OTC), che è una tecnica accettata e valida per FP ^{1,2, 3}, è l'unica opzione. L'obiettivo dell'OTC è quello di crioconservare migliaia di follicoli primordiali dormienti nel tessuto della corteccia ovarica, che possono riprendere la crescita dopo il trapianto di tessuto congelato/scongelato nell'ovaio rimanente o in una tasca peritoneale dopo l'attento screening della malattia residua minima in frammenti di tessuto rappresentativi.

Per ottenere frammenti corticali di 1-2 mm di spessore adatti alla crioconservazione, è necessario rimuovere il tessuto midollare molle. Questo tessuto midollare comporta tipicamente follicoli in crescita in vari stadi di sviluppo che sfuggono alla corteccia ovarica rigida per consentirne la crescita e l'espansione⁴. Per molti anni, diversi laboratori hanno studiato il potenziale di questi ovociti recuperati dai follicoli che risiedono nel tessuto midollare residuo dopo la preparazione di frammenti corticali ovarici utilizzando la maturazione in vitro (IVM)^5,6,7, denominata IVM di ovociti del tessuto ovarico (OTO-IVM). I follicoli antrali, anche quelli di diametro inferiore a 6 mm, contengono ovociti immaturi circondati da cellule cumuliformi che possono maturare, fecondare e svilupparsi in bambini sani utilizzando un sistema IVM ^8,9. L'IVM è considerata lo standard di cura per le donne a rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS), come le pazienti con sindrome dell'ovaio policistico (PCOS). Tuttavia, nel campo della FP, ci sono dati limitati disponibili per IVM nei casi con una controindicazione alla stimolazione ovarica; L'IVM degli ovociti raccolti per via transvaginale è ancora considerata innovativa e l'OTO-IVM è considerato sperimentale ^2,10. Detto questo, i rapporti sui primi nati vivi dopo OTO-IVM^11,12,13 evidenziano il potenziale dell'utilizzo di OTO-IVM come tecnica aggiuntiva quando l'OTC è richiesto per la FP nei pazienti¹⁴.

Questo studio fornisce dettagli tecnici per l'adozione di OTO-IVM nel laboratorio MAR e illustra i risultati ottenuti in un singolo centro.

Protocollo

Il presente studio sull'OTO-IVM è stato approvato dal Comitato Etico locale dell'UZ-Bruxelles (addendum del progetto 2008/068 e del progetto 2022/303). Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato scritto. Ogni paziente è stato valutato individualmente da un medico specialista in medicina riproduttiva, da un infermiere navigatore e dall'oncologo di riferimento per comporre il piano di trattamento FP ottimale, tenendo conto delle preferenze del paziente¹⁴. In breve, i pazienti eleggibili per l'OTC hanno urgente bisogno di FP e hanno meno di 36 anni e¹⁴ anni. Per combinare l'OTC con l'OTO-IVM, la chemioterapia o la radioterapia non possono essere state somministrate nei 6 mesi precedenti l'OTC.

1. Ambiente di laboratorio e personale

1. Esecuzione OTC in una cappa a flusso laminare di Classe A.
2. Eseguire l'OTC con due operatori: uno che lavora in modo asettico nella cabina a flusso laminare e un secondo che pulisce tutti i materiali non sterili con uno spray decontaminante battericida e sporicida e consegna i materiali e le forniture in modo asettico al primo operatore. Lavorare la corteccia ovarica su un coperchio di raffreddamento da banco (± 4 °C).
3. Eseguire la ricerca del complesso cumulo-ovocita (COC) in una seconda cappa a flusso laminare con uno stereomicroscopio in un laboratorio MAR su un tavolino riscaldato (37 °C).
4. Eseguire il recupero del COC dai resti midollari (sezioni 3 e 4) e avviare il processo IVM (sezione 5). Questa operazione viene eseguita da un terzo operatore.

2. Preparazione dei terreni

NOTA: Per questa procedura vengono utilizzati cinque tipi di supporti (descritti di seguito): mezzo di manipolazione OTC, mezzo di congelamento OTC, mezzo di ricerca, mezzo LAG e mezzo IVM. Quando si preparano i fluidi, lavorare in modo asettico nella camera di flusso, come descritto nella sezione 1. Utilizzare reagenti nuovi e non aperti per ogni procedura e mantenere la sterilità di tutti i prodotti monouso utilizzati per accertare la sterilità dei terreni prodotti.

1. Mezzo di movimentazione OTC
   1. Integrare il terreno L15 di Leibovitz con 4 mg/mL di albumina sierica umana (HSA), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Conservare il mezzo di manipolazione OTC in frigorifero fino all'uso (per un massimo di 2 giorni).
      NOTA: Utilizzare il mezzo di manipolazione OTC per sciacquare e lavorare il tessuto ovarico e utilizzarlo a freddo (0-4 °C).
2. Mezzo di congelamento OTC
   1. Integrare il terreno L15 di Leibovitz con 1,5 M di dimetilsolfossido (DMSO) e 4 mg/mL di HSA.
   2. Conservare il mezzo di congelamento OTC in frigorifero fino all'uso (per un massimo di 2 giorni).
3. Mezzo di ricerca
   NOTA: Il terreno di ricerca (un terreno tamponato HEPES per la manipolazione degli ovociti) è disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e pronto per l'uso. Utilizzare il mezzo di ricerca per sciacquare il filtro e raccogliere il COC durante la ricerca di COC tra i frammenti del midollo (sezione 4).
   1. Riempire sei provette sterili a fondo tondo da 14 mL con 6 mL di terreno di ricerca.
   2. Preparare una capsula a 4 pozzetti con 500 μl di terreno di ricerca ricoperta da 350 μl di olio (vedere la tabella dei materiali).
   3. Riscaldare le provette e la capsula a 4 pozzetti a 37 °C per almeno 1 ora prima dell'arrivo del tessuto ovarico. I terreni tamponati con HEPES non richiedono l'incubazione di CO₂ .
4. LAG medio
   NOTA: Il sistema IVM disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) comprende due diversi supporti: LAG medium e IVM medium, che devono essere integrati come descritto di seguito. Il terreno LAG viene utilizzato per il risciacquo dei COC, ma può essere utilizzato anche per un periodo di incubazione di 2-3 ore che precede l'IVM in mezzo IVM, come suggerito dall'inserto del sistema IVM.
   1. Utilizzare il mezzo LAG disponibile in commercio e pronto all'uso (vedere la tabella dei materiali).
5. IVM medium
   1. Integrare il terreno IVM disponibile in commercio con 10 mg/mL di HSA, 75 mIU/mL di ormone follicolo-stimolante (FSH) e 100 mIU/mL di gonadotropina corionica umana (hCG).
   2. Preparare una piastra di coltura a 4 pozzetti con un pozzetto di terreno LAG e tre pozzetti di terreno IVM integrato: 500 μL di terreno coperti con 350 μL di olio di ricopertura.
   3. Equilibrare la piastra per una notte in un'incubatrice a 37 °C al 6% di CO₂ e al 20% di O₂, l'ambiente ottimale per la coltura IVM.

3. Preparazione della corteccia ovarica

NOTA: La rimozione laparoscopica dell'ovaio intero è stata eseguita come descritto da Jadoul et ^al.15.

1. All'arrivo dell'ovaio in laboratorio, lavare l'ovaio nel mezzo di manipolazione OTC (fase 2.1) due volte trasferendo l'ovaio in una piastra di Petri da 100 mm con il mezzo di manipolazione OTC.
2. Con un bisturi, tagliare l'ovaio a metà longitudinalmente (Figura 1A).
3. Praticare diverse incisioni nel tessuto midollare sia verticalmente che orizzontalmente con un bisturi fresco. Evita di danneggiare la corteccia. Forare delicatamente i follicoli antrali sodi di varie dimensioni all'interno del midollo con il bisturi per rilasciare il fluido follicolare nel mezzo di manipolazione OTC.
4. Ridurre il tessuto midollare molle con le forbici chirurgiche (Figura 1B). Questa procedura può richiedere diversi minuti.
5. Metti il guscio ovarico in un nuovo piatto con un mezzo di manipolazione OTC fresco durante il processo di rifilatura.
6. Trasferire la piastra con i frammenti midollari e il liquido follicolare rilasciato (Figura 1C) nella seconda cabina di flusso per iniziare la ricerca dei COC.
7. Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.6 fino ad ottenere lo spessore desiderato (1-2 mm) del tessuto della corteccia.
8. Tagliare la corteccia in pezzi di circa 8 mm x 5 mm.
9. Incubare i pezzi 3 volte consecutivamente per 10 minuti in circa 25 mL di terreno di congelamento OTC (fase 2.2) in piastre di Petri da 100 mm.
10. Mettere un pezzo in 800 μl di mezzo di congelamento OTC in un crioviale.
11. Crioconservazione del tessuto ovarico utilizzando un protocollo di congelamento lento in una criocamera controllata da un regolatore di temperatura (vedi Tabella dei materiali): da 4 °C a -7 °C a -2 °C/min, semina manuale a -7 °C, da -7 °C a -40 °C a -0,3 °C/min, da -40 °C a -100 °C a -10 °C/min, e a -100 °C immergere i crioviali in azoto liquido e conservarli.

4. Cerca i COC

1. Preparare la cabina a flusso laminare per la ricerca COC.
   1. Piastre di coltura calde da 60 mm sul tavolino riscaldato sotto lo stereomicroscopio nella camera a flusso laminare.
   2. Mettere le provette da 14 mL con 6 mL di terreno di ricerca preriscaldato (passaggio 2.3.1) in un blocco riscaldato e la piastra preriscaldata a 4 pozzetti con il terreno di ricerca sul tavolino riscaldato al microscopio nella camera a flusso laminare.
   3. Collocare un filtro sterile (filtro cellulare, dimensione della maglia 70 μm; vedere Tabella dei materiali) dal basso verso il basso in un piatto di coltura.
   4. Prelevare un capillare in vetro da 290-310 μm per l'uso: non utilizzare capillari più piccoli di 290-310 μm, al fine di evitare danni alla connettività ovocita-cumulocellula.
   5. Assicurarsi che siano disponibili puntali con filtro da 1 ml e una pipetta da 1 ml.
2. Prelevare la prima piastra con frammenti midollari dalla camera a flusso laminare OTC (4 °C) e mettere la piastra sul tavolino riscaldato (37 °C) nella camera a flusso laminare IVM il prima possibile.
   NOTA: Il primo piatto di frammenti midollari e liquido follicolare potrebbe essere contaminato da sangue proveniente da follicoli ovulati pieni di sangue o dalla vascolarizzazione dell'ovaio stesso. I globuli rossi offuscano la visione chiara e complicano la ricerca dei COC. Il terreno contaminato deve essere rimosso per lavare via i globuli rossi (vedere punto 4.3).
3. Rimuovere la contaminazione delle cellule del sangue seguendo i passaggi seguenti.
   1. Pipett 2 mL di terreno di ricerca sulla membrana filtrante (filtro cellulare da 70 μm) per bagnare la membrana e mettere da parte il piatto, che ha catturato il mezzo, sul tavolino riscaldato.
   2. Capovolgere il filtro e posizionarlo con la maniglia contro il bordo di un nuovo piatto di coltura, creando una pendenza con il fondo del filtro.
   3. Raccogliere il terreno contaminato dal sangue tra i frammenti midollari utilizzando un puntale da 1 ml e soffiarlo delicatamente sulla membrana del filtro (Figura 1D) per catturare i COC presenti nel mezzo contaminato.
   4. Ripetere il passaggio 4.3.3 fino a rimuovere la maggior parte del mezzo contaminato dal sangue.
   5. Versare immediatamente il terreno di ricerca fresco sui frammenti midollari per mantenere sempre il COC sospeso nel terreno di coltura.
   6. Sciacquare delicatamente la membrana inclinata del filtro con 2 ml di terreno di ricerca per sciacquare via i globuli rossi sulla membrana del filtro.
   7. Posizionare il filtro dal basso verso il basso in una nuova capsula e versare 3-4 ml di terreno di ricerca nel filtro per espellere il COC dalla membrana del filtro nel mezzo che riempie la capsula. Rimuovere il filtro. Per garantire che la membrana del filtro non si asciughi (e che eventuali COC non siano ancora stati espulsi da essa), immergere il filtro dal basso verso il basso nel primo piatto, che è stato utilizzato per bagnare il filtro per la prima volta.
   8. Esaminare immediatamente il mezzo espulso per verificare la presenza di COC mediante ispezione visiva al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di 10x-50x. Cerca ovociti trasparenti e traslucidi con un bordo di cellule cumulorose circostanti scure e compatte (Figura 1E). Agitare il terreno nel piatto ed esaminarlo di nuovo.
   9. Sciacquare il filtro una seconda volta in un nuovo piatto ed esaminare il mezzo espulso per verificare la presenza di COC.
   10. Esaminare il mezzo nella parabola in cui è immerso il filtro per i COC rimanenti.
   11. Trasferire i COC con un capillare di vetro nella piastra a 4 pozzetti contenente il mezzo di ricerca (Figura 1E). Tenete sempre i piatti sul palco riscaldato.
4. Cerca tra i frammenti midollari i COC dopo aver rimosso le cellule del sangue contaminanti dalla piastra con frammenti midollari e aver riempito la piastra con un terreno di ricerca chiaro. Usa il capillare di vetro per muoverti intorno ai frammenti midollari e fai roteare il mezzo nel piatto per trovare i COC. Estrarre grandi frammenti midollari con aghi per tubercolina su una siringa da 1 ml se si sospetta la presenza di un ovocita.
5. Raccogli tutti i COC intatti nella capsula a 4 pozzetti con il mezzo di ricerca.
   NOTA: In una tipica procedura OTC, il tessuto cortecali viene ridotto dal midollo utilizzando tre piastre consecutive da 100 mm, dove il guscio ovarico viene spostato in una nuova piastra con terreno fresco e dove i resti vengono trasferiti al flusso IVM per la ricerca COC. Di solito, solo il primo piatto richiede la rimozione delle cellule del sangue; nel secondo e nel terzo piatto, sono presenti meno frammenti midollari e la ricerca del COC viene eseguita direttamente tra i frammenti e nel mezzo.

5. IVM dei COC

1. Sciacquare i COC in un pozzetto pulito con il mezzo di ricerca.
2. Spostare la piastra di coltura IVM pre-bilanciata (la piastra a 4 pozzetti che contiene un pozzetto di terreno LAG e tre pozzetti di terreno IVM) dall'incubatore al palco riscaldato nella cappa di flusso IVM.
3. Etichettare la piastra di coltura IVM contenente i COC con le informazioni sul paziente.
4. Sciacquare i COC in terreno LAG (2-3 s) e metterli in uno dei tre pozzetti con il terreno IVM integrato. Coltivare i COC in gruppi di circa 10 COC per pozzetto. Omettere gli ovociti nudi - ovociti privi di cellule cumululi attaccate - dalla coltura, poiché sono noti per avere un potenziale di sviluppo gravemente compromesso.
5. Mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C, 6% CO₂ e 20% O₂ per 30 ore.

6. Manipolazione di ovociti maturi

1. Privare gli ovociti delle cellule del cumulo circostanti mediante una breve esposizione a 80 UI di ialuronidasi (vedi Tabella dei materiali) e un delicato pipettaggio meccanico dopo 30 ore di IVM.
2. Identificare gli ovociti maturi mediante l'estrusione del primo globulo polare.
3. Vitrificare o inseminare gli ovociti maturi, a seconda delle preferenze della paziente.
   NOTA: Se il controllo di maturazione dopo 30 ore di IVM non rientra nell'orario di lavoro consentito, la durata dell'IVM può essere ridotta a 28 ore o estesa fino a 42 ore. Se dopo 30 ore si ottengono solo pochi ovociti maturi, gli ovociti immaturi possono essere coltivati ulteriormente durante la notte nel pozzetto IVM originale, privo di cellule cumuliformi, e utilizzati la mattina successiva per la vitrificazione o l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) quando maturi.

Risultati

Nell'ultimo decennio, a 98 pazienti sottoposte a ovariectomia o biopsia ovarica per OTC è stato offerto anche l'OTO-IVM. I risultati qui presentati sono un aggiornamento del programma clinico pubblicato prima del ^7,13. Gli ovociti immaturi ottenuti durante il processamento del tessuto ovarico sono stati fatti maturare in vitro prevalentemente per 30 ore. Tuttavia, un tempo di maturazione più flessibile è stato consent...

Discussione

La priorità della procedura FP è sempre quella di manipolare e congelare la corteccia ovarica secondo il protocollo operativo standard che è stato convalidato in clinica. Uno svantaggio della FP è l'assenza di un protocollo standard disponibile nella letteratura pubblicata per quanto riguarda OTC e OTO-IVM. È difficile valutare l'efficienza e la validità delle tecniche e degli adattamenti poiché esiste un ampio intervallo di tempo tra il congelamento/vitrificazione e lo scongelame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal