Oócito de tecido ovariano - maturação in vitro para preservação da fertilidade

Resumo

Apresentamos aqui a maturação in vitro de oócitos de tecido ovariano (OTO-IVM), uma técnica acessível dentro de um laboratório de reprodução assistida por médicos (MAR) que oferece opções adicionais realistas de preservação da fertilidade para pacientes que precisam de criopreservação de tecido ovariano.

Resumo

A vitrificação de oócitos maduros é o padrão de tratamento para preservar a fertilidade em mulheres com risco de infertilidade. No entanto, a criopreservação do tecido ovariano (OTC) ainda é a única opção para preservar a fertilidade em mulheres que precisam iniciar o tratamento gonadotóxico com urgência ou em crianças pré-púberes. Durante a preparação do córtex ovariano para criopreservação, o tecido medular é removido. Os folículos antrais em crescimento residem na borda da interface córtex-medular do ovário e são quebrados durante esse processo, liberando seu complexo cumulus-oócito (COC). Ao inspecionar minuciosamente o tecido medular médio e fragmentado, esses complexos cumulus-oócitos imaturos podem ser identificados sem interferir no procedimento OTC. Os oócitos imaturos derivados do tecido ovariano podem ser amadurecidos com sucesso in vitro, criando uma fonte adicional de gametas para preservação da fertilidade. Se o OTC for realizado dentro ou perto de um laboratório de reprodução medicamente assistida, todas as ferramentas necessárias de maturação in vitro (IVM) e vitrificação de oócitos podem estar disponíveis. Além disso, após a remissão e o desejo da criança, a paciente tem várias opções para restauração da fertilidade: transplante de tecido ovariano ou transferência de embriões após a inseminação de oócitos vitrificados/aquecidos. Portanto, a maturação in vitro de oócitos de tecido ovariano (OTO-IVM) pode ser uma valiosa técnica adjuvante de preservação da fertilidade.

Introdução

As opções de preservação da fertilidade (PF) para mulheres planejadas para tratamento gonadotóxico, terapia de redesignação sexual ou mulheres com predisposição genética para insuficiência ovariana prematura dependem da saúde e da idade da paciente, do prazo disponível, do tipo de tratamento, da preferência da paciente e dos procedimentos de PF disponíveis no centro de fertilidade de sua escolha. A vitrificação de oócitos maduros obtidos após estimulação ovariana com gonadotrofinas e recuperação de oócitos em um ciclo laboratorial de reprodução medicamente assistida (MAR) é considerada a opção preferida para FP ^1,2. No entanto, para meninas pré-púberes, mulheres nas quais é necessário o início urgente do tratamento gonadotóxico ou gonadectomia, ou mulheres com alto risco de amenorreia permanente devido ao tratamento gonadotóxico, um ciclo de estimulação ovariana com gonadotrofinas não é possível, e a criopreservação do tecido ovariano (OTC), que é uma técnica aceita e válida para FP ^{1,2, 3}, é a única opção. O objetivo do OTC é criopreservar milhares de folículos primordiais dormentes no tecido do córtex ovariano, que podem retomar o crescimento após o transplante de tecido congelado / descongelado no ovário remanescente ou em uma bolsa peritoneal após a triagem cuidadosa de doença residual mínima em fragmentos de tecido representativos.

Para obter fragmentos corticais de 1-2 mm de espessura adequados para criopreservação, o tecido medular mole precisa ser removido. Esse tecido medular normalmente envolve folículos em crescimento em vários estágios de desenvolvimento que escapam do córtex ovariano rígido para permitir seu crescimento e expansão⁴. Por muitos anos, vários laboratórios têm investigado o potencial desses oócitos recuperados de folículos residentes no tecido medular remanescente após a preparação do fragmento cortical ovariano usando maturação in vitro (MIV)^5,6,7, referida como oócito de tecido ovariano IVM (OTO-IVM). Os folículos antrais, mesmo aqueles com menos de 6 mm de diâmetro, contêm oócitos imaturos cercados por células do cumulus que podem amadurecer, fertilizar e se desenvolver em bebês saudáveis usando um sistema IVM ^8,9. A MIV é considerada o padrão de atendimento para mulheres com risco de síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS), como pacientes com síndrome dos ovários policísticos (SOP). No entanto, no campo do PF, há dados limitados disponíveis para MIV em casos com contraindicação para estimulação ovariana; A MIV de oócitos coletados por via transvaginal ainda é considerada inovadora, e a MIO-IV é considerada experimental ^2,10. Dito isso, os relatos dos primeiros nascidos vivos após a OTO-IVM^11,12,13 destacam o potencial do uso da OTO-IVM como técnica complementar quando a OTC é necessária para PF em pacientes¹⁴.

Este estudo fornece detalhes técnicos para a adoção da OTO-IVM no laboratório do MAR e ilustra os resultados obtidos em um único centro.

Protocolo

O presente estudo sobre a OTO-IVM foi aprovado pelo Comitê de Ética local da UZ-Bruxelas (adendo do projeto 2008/068 e do projeto 2022/303). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Cada paciente foi avaliado individualmente por um médico especialista em medicina reprodutiva, enfermeiro navegador e oncologista de referência para compor o plano de tratamento ideal de PF, levando em consideração as preferências do paciente¹⁴. Em suma, os pacientes elegíveis para OTC têm necessidade urgente de PF e têm menos de 36 anos de idade¹⁴. Para combinar OTC com OTO-IVM, quimio- ou radioterapia não pode ter sido administrada nos 6 meses anteriores ao OTC.

1. Ambiente e pessoal do laboratório

1. Execute OTC em um gabinete de fluxo laminar Classe A.
2. Realize OTC com dois operadores: um trabalhando assepticamente no gabinete de fluxo laminal e um segundo limpando todos os materiais não estéreis com um spray descontaminante bactericida e esporicida e entregando materiais e suprimentos assepticamente ao primeiro operador. Processe o córtex ovariano em uma tampa de refrigerador de bancada (± 4 °C).
3. Realizar a pesquisa do complexo cumulus-oócito (COC) num segundo armário de fluxo laminar com um estereomicroscópio num laboratório MAR numa fase aquecida (37 °C).
4. Realize a recuperação do COC dos remanescentes medulares (seções 3 e 4) e inicie o processo de MIV (seção 5). Isso é feito por um terceiro operador.

2. Preparação de mídia

NOTA: Cinco tipos de mídia são usados para este procedimento (detalhado abaixo): meio de manuseio OTC, meio de congelamento OTC, meio de pesquisa, meio LAG e meio IVM. Ao preparar o meio, trabalhe assepticamente no gabinete de fluxo, conforme detalhado na seção 1. Use reagentes novos e fechados para cada procedimento e mantenha a esterilidade de todos os descartáveis usados para verificar a esterilidade do meio produzido.

1. Meio de manipulação OTC
   1. Suplementar o meio L15 de Leibovitz com 4 mg/mL de albumina sérica humana (HSA), 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
   2. Mantenha o meio de manuseio OTC refrigerado até o uso (por no máximo 2 dias).
      NOTA: Use o meio de manuseio OTC para enxaguar e processar o tecido ovariano e use-o frio (0-4 °C).
2. Meio de congelamento OTC
   1. Suplemente o meio L15 de Leibovitz com 1,5 M de dimetilsulfóxido (DMSO) e 4 mg/mL de HSA.
   2. Mantenha o meio de congelamento OTC refrigerado até o uso (por no máximo 2 dias).
3. Meio de pesquisa
   NOTA: O meio de pesquisa (um meio tamponado com HEPES para manuseio de oócitos) está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) e pronto para uso. Use o meio de pesquisa para enxaguar o filtro e coletar o COC enquanto procura por COCs entre os fragmentos da medula (seção 4).
   1. Encha seis tubos estéreis de fundo redondo de 14 mL com 6 mL de meio de pesquisa.
   2. Prepare um prato de 4 poços com 500 μL de meio de pesquisa coberto com 350 μL de óleo (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Aqueça os tubos e a placa de 4 poços a 37 °C por pelo menos 1 h antes da chegada do tecido ovariano. Os meios tamponados com HEPES não requerem incubação de CO₂ .
4. Meio LAG
   NOTA: O sistema IVM disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) compreende dois meios diferentes: meio LAG e meio IVM, que precisa ser complementado conforme detalhado abaixo. O meio LAG é usado para enxaguar os COCs, mas também pode ser usado por um período de incubação de 2-3 h antes do IVM em meio IVM, conforme sugerido pela inserção do sistema IVM.
   1. Use o meio LAG disponível comercialmente e pronto para uso (consulte a Tabela de Materiais).
5. Meio IVM
   1. Suplemente o meio de MIV disponível comercialmente com 10 mg/mL de HSA, 75 mUI/mL de hormônio folículo estimulante (FSH) e 100 mUI/mL de gonadotrofina coriônica humana (hCG).
   2. Prepare uma placa de cultura de 4 poços com um poço de meio LAG e três poços de meio IVM suplementado: 500 μL de meio coberto com 350 μL de camada de óleo.
   3. Equilibre o prato durante a noite em uma incubadora a 37 ° C em 6% de CO₂ e 20% de O₂, o ambiente ideal para a cultura de IVM.

3. Preparação do córtex ovariano

NOTA: A remoção laparoscópica de todo o ovário foi realizada conforme descrito por Jadoul et ^al.15.

1. Após a chegada do ovário ao laboratório, lave-o no meio de manipulação OTC (etapa 2.1) duas vezes, transferindo o ovário para uma placa de Petri de 100 mm com o meio de manipulação OTC.
2. Com um bisturi, corte o ovário ao meio longitudinalmente (Figura 1A).
3. Faça várias incisões no tecido medular vertical e horizontalmente com um bisturi fresco. Evite danificar o córtex. Perfure suavemente os folículos antrais firmes de vários tamanhos dentro da medula com o bisturi para liberar o fluido folicular no meio de manuseio OTC.
4. Cortar o tecido da medula mole com tesoura cirúrgica (Figura 1B). Este procedimento pode levar vários minutos.
5. Coloque a casca ovariana em um novo prato com meio de manuseio OTC fresco durante o processo de corte.
6. Transferir a placa com fragmentos medulares e fluido folicular liberado (Figura 1C) para o segundo gabinete de fluxo para iniciar a busca de COCs.
7. Repita as etapas 3.4 a 3.6 até obter a espessura desejada (1-2 mm) do tecido do córtex.
8. Corte o córtex em pedaços de aproximadamente 8 mm x 5 mm.
9. Incubar as peças 3x consecutivamente por 10 min em aproximadamente 25 mL de meio de congelamento OTC (etapa 2.2) em placas de Petri de 100 mm.
10. Coloque uma peça em 800 μL de meio de congelamento OTC em um criogenial.
11. Criopreservar o tecido ovariano usando um protocolo de congelamento lento em uma câmara criogênica controlada por um controlador de temperatura (ver Tabela de Materiais): de 4 °C a -7 °C a -2 °C/min, semeadura manual a -7 °C, de -7 °C a -40 °C a -0,3 °C/min, de -40 °C a -100 °C a -10 °C/min, e a -100 °C mergulhe os criotubos em nitrogênio líquido e armazene-os.

4. Pesquise por COCs

1. Prepare o gabinete de fluxo laminar para a busca do COC.
   1. Aquecer as placas de cultura de 60 mm na fase aquecida sob o estereomicroscópio na câmara de fluxo laminar.
   2. Coloque os tubos de 14 mL com 6 mL de meio de pesquisa pré-aquecido (etapa 2.3.1) em um bloco aquecido e o prato pré-aquecido de 4 poços com meio de pesquisa no estágio aquecido sob o microscópio no gabinete de fluxo laminar.
   3. Coloque um filtro estéril (filtro de células, tamanho de malha de 70 μm; consulte Tabela de Materiais) de baixo para baixo em uma placa de cultura.
   4. Pegue um capilar de vidro de 290-310 μm para uso: não use capilares menores que 290-310 μm, a fim de evitar danos à conectividade oócito-célula cumulus.
   5. Certifique-se de que as pontas do filtro de 1 mL e uma pipeta de 1 mL estejam disponíveis.
2. Retire o primeiro prato com fragmentos medulares do gabinete de fluxo laminar OTC (4 °C) e coloque o prato no aquecido stage (37 °C) no gabinete de fluxo laminar IVM o mais rápido possível.
   NOTA: O primeiro prato de fragmentos medulares e fluido folicular pode estar contaminado com sangue de folículos ovulados cheios de sangue ou da própria vasculatura do ovário. Os glóbulos vermelhos embaçam a visão clara e complicam a busca por COCs. O meio contaminado deve ser removido para lavar os glóbulos vermelhos (consulte a etapa 4.3).
3. Remova a contaminação das células sanguíneas seguindo as etapas abaixo.
   1. Pipet 2 mL de meio de pesquisa sobre a membrana do filtro (filtro de células de 70 μm) para molhar a membrana e colocar o prato, que capturou o meio, de lado no estágio aquecido.
   2. Vire o filtro de cabeça para baixo e coloque-o com a alça contra a borda de um novo prato de cultura, criando uma inclinação com a parte inferior do filtro.
   3. Colete o meio contaminado com sangue entre os fragmentos medulares usando uma ponta de 1 mL e sopre-o suavemente sobre a membrana do filtro (Figura 1D) para capturar os COCs presentes no meio contaminado.
   4. Repita a etapa 4.3.3 até que a maior parte do meio contaminado com sangue seja removida.
   5. Despeje o meio de pesquisa fresco sobre os fragmentos medulares imediatamente para manter o COC suspenso no meio de cultura o tempo todo.
   6. Enxágue a membrana do filtro inclinada suavemente com 2 mL de meio de pesquisa para enxaguar os glóbulos vermelhos da membrana do filtro.
   7. Coloque o filtro de baixo para baixo em um novo prato e despeje 3-4 mL de meio de pesquisa no filtro para expelir o COC da membrana do filtro para o meio que preenche o prato. Remova o filtro. Para garantir que a membrana do filtro não seque (e quaisquer possíveis COCs que ainda não foram expelidos dela), mergulhe o filtro de baixo para baixo no primeiro prato, que foi usado para molhar o filtro pela primeira vez.
   8. Examine imediatamente o meio expelido para COCs por inspeção visual sob um microscópio estéreo com uma ampliação de 10x-50x. Procure oócitos translúcidos claros com uma borda de células do cumulus circundante escuras e compactas (Figura 1E). Gire o meio no prato e examine o meio novamente.
   9. Enxágue o filtro uma segunda vez em um novo prato e examine o meio expelido para ver se há COCs.
   10. Examine o meio no prato onde o filtro está imerso para os COCs restantes.
   11. Transfira os COCs com um capilar de vidro para o prato de 4 poços contendo o meio de pesquisa (Figura 1E). Mantenha a louça sempre aquecida.
4. Procure entre os fragmentos medulares por COCs depois de remover as células sanguíneas contaminantes do prato com fragmentos medulares e reabastecer o prato com meio de pesquisa transparente. Use o capilar de vidro para mover os fragmentos medulares e gire o meio no prato para encontrar COCs. Separe grandes fragmentos medulares com agulhas de tuberculina em uma seringa de 1 mL se houver suspeita da presença de um oócito.
5. Colete todos os COCs intactos no prato de 4 poços com meio de pesquisa.
   NOTA: Em um procedimento típico de OTC, o tecido do córtex é reduzido da medula usando três placas consecutivas de 100 mm, onde a casca ovariana é movida para uma nova placa com meio fresco e onde os restos são transferidos para o fluxo de IVM para pesquisa de COC. Normalmente, apenas o primeiro prato requer a remoção de células sanguíneas; na segunda e terceira placas, menos fragmentos medulares estão presentes, e a busca de COC é realizada diretamente entre os fragmentos e no meio.

5. MIV de AOCs

1. Enxágue os COCs em um poço limpo com meio de pesquisa.
2. Mova a placa de cultura IVM pré-equilibrada (a placa de 4 poços que contém um poço de meio LAG e três poços de meio IVM) da incubadora para o estágio aquecido no gabinete de fluxo IVM.
3. Rotule a placa de cultura de MIV contendo AOCs com informações do paciente.
4. Enxágue os COCs em meio LAG (2-3 s) e coloque-os em um dos três poços com meio IVM suplementado. Cultive os COCs em grupos de aproximadamente 10 COCs por poço. Omita oócitos nus - oócitos desprovidos de células do cumulus anexadas - da cultura, pois eles são conhecidos por terem potencial de desenvolvimento gravemente comprometido.
5. Coloque o prato em uma incubadora a 37 °C, 6% de CO₂ e 20% de O₂ por 30 h.

6. Manuseio de oócitos maduros

1. Retire os oócitos de suas células do cumulus circundante por breve exposição a 80 UI de hialuronidase (ver Tabela de Materiais) e pipetagem mecânica suave após 30 h de IVM.
2. Identifique oócitos maduros pela extrusão do primeiro corpo polar.
3. Vitrificar ou inseminar os oócitos maduros, dependendo da preferência da paciente.
   NOTA: Se a verificação de maturação após 30 h de IVM estiver fora do horário de trabalho aceitável, a duração do IVM pode ser reduzida para 28 h ou estendida até 42 h. Se apenas alguns oócitos maduros forem obtidos após 30 h, os oócitos imaturos podem ser cultivados adicionalmente durante a noite no poço original de MIV, desprovido de células do cumulus, e usados na manhã seguinte para vitrificação ou injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) quando maduros.

Resultados

Na última década, 98 pacientes submetidas a ooforectomia ou biópsia ovariana para OTC também receberam OTO-IVM. Os resultados aqui apresentados são uma atualização do programa clínico publicado anteriormente ^7,13. Oócitos imaturos obtidos durante o processamento do tecido ovariano foram amadurecidos in vitro predominantemente por 30 h. No entanto, um tempo de maturação mais flexível foi permitido por razões ...

Discussão

A prioridade do procedimento de PF é sempre manipular e congelar o córtex ovariano de acordo com o protocolo operacional padrão que foi validado na clínica. Uma desvantagem no PF é a ausência de um protocolo padrão disponível na literatura publicada sobre OTC e OTO-IVM. É difícil avaliar a eficiência e validade das técnicas e adaptações, uma vez que há um grande intervalo de tempo entre o congelamento/vitrificação e o descongelamento/aquecimento em um ambiente clínico. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal