长时间循环停止后体外心肺复苏的小儿动物模型

摘要

该协议描述了体外循环 （CPB） 的新生儿猪模型，将循环和心脏骤停作为研究继发于 CPB 的严重脑损伤和其他并发症的工具。

摘要

先天性心脏病 （CHD） 是最普遍的先天性畸形，全世界每年约有 100 万新生儿受到影响。对这种疾病的全面研究需要适当且经过验证的动物模型。仔猪由于其相似的解剖学和生理学而通常用于转化研究。这项工作旨在描述和验证具有循环和心脏骤停 （CA） 的体外循环 （CPB） 新生儿仔猪模型作为研究严重脑损伤和心脏手术其他并发症的工具。除了包括材料清单外，这项工作还为其他研究人员规划和执行该协议提供了路线图。在经验丰富的从业人员进行了几次试验后，该模型的代表性结果显示成功率为92%，失败归因于仔猪大小小和血管解剖结构变异。此外，该模型允许从业者从各种各样的实验条件中进行选择，包括 CA 的不同时间、温度变化和药物干预。总之，该方法使用大多数医院环境中现成的材料，可靠且可重复，可广泛用于增强接受心脏手术的儿童的转化研究。

引言

先天性心脏病 （CHD） 是最普遍的先天性畸形，全世界每年约有 100 万新生儿受到影响¹。尽管心胸外科 （CTS） 和重症监护治疗的现代进步提高了死亡率，但合并症仍然极为常见 2,3,4,5。据报道，这些患者中约有 25%-50% 存在神经发育异常，包括认知和运动障碍以及学习障碍 ^6,7,8。在生命的最初几天进行手术，尤其是那些需要循环和心脏骤停 （CA） 的手术，已被证明会增加发病率⁹。手术期间的血流动力学改变可能对脆弱发育中的新生儿大脑产生重要影响。实验模型对于更好地了解这些异常的根源并研究神经保护策略以改善这些患者的预后至关重要。

使用动物模型研究该群体已被广泛记录 5,10,11,12,13,14。值得注意的是，鉴于仔猪在心脏解剖学（图1）、基因组和生理学方面非常接近，而且与其他^{动物模型相比}，仔猪的体型相对较大（图2）。使用仔猪模型来研究体外循环（CPB）和冠状动脉的影响已经有过描述。这些实验动物模型可用于研究血流动力学变化和相关的终末组织器官并发症 14,16,17,18,19,20。这些模型的开发是为了让研究人员能够在受控环境中研究人类状况，并具有适用于各种实验条件的灵活性。大多数研究报告了中心插管的使用，这种技术需要先进的手术技能，需要更高的资源利用率，并且难以确保长期生存。尽管先前的研究记录了在研究 CPB^12,15 中使用仔猪，但很少有人提出外周插管技术。

与其他已发表的研究相比，这种新的外周插管技术更容易、侵袭性更小、更可行¹⁹。此外，在新生儿和小动物中验证该技术是新颖的，所有有兴趣使用动物模型研究冠心病及其相关合并症的研究人员都应该考虑使用。对于能够进入配备有用品、资源和具有进行动物模型实验经验的人员的实验室的个人来说，这尤其合适。

总之，本研究的主要目的是描述和验证 CPB 伴 CA 的新生仔猪模型。该方案旨在研究在具有不同实验条件的受控环境中进行 CPB 手术的严重脑损伤和其他可能的并发症。该方法提供了一种可推广、可靠且高质量的模型，可用于各种实验方案。

研究方案

本程序已得到加泰罗尼亚比较医学和生物影像中心（CEEA-CMCiB）的动物实验伦理委员会（CEEA）的批准。加泰罗尼亚政府还授权了实验协议（编号11652），文件识别号FUE-2022-02381434和ID QBXQ3RY3J。经验丰富的从业人员，包括提供监督和帮助的认证兽医，进行了所有实验。本研究采用4-6日龄、体重2.5-3.5kg的仔猪（Sus scrofa domestica）。试图平衡性别分布，以避免相关的偏见。

1. 镇静、插管和通路

1. 肌内注射氯胺酮 （20 mg/kg）、右美托咪定 （0.02 mg/kg） 和咪达唑仑 （0.3 mg/kg） 开始镇静和镇痛。一旦对动物进行深度镇静（给药前用药后5分钟），通过鼻罩（2L / min）用100%O₂ 氧合。接下来，用IV丙泊酚（0.5mg / kg）诱导麻醉（参见 材料表）。
2. 将仔猪置于背卧位。使用 2.5 mm 带套囊的气管插管（参见 材料表）进行经口气管插管，使用气管的直接可视化。
   1. 通过直接听诊肺基底，确认适当的气管插管放置。
3. 将机械通气设置为呼吸频率为每分钟 30 次呼吸，潮气量为 8-12 mL/kg，呼气末压力为 4 cmH₂O。
4. 在方案期间 通过 心率 （HR）、血压 （BP） 和血氧饱和度 （spO2） 持续监测麻醉深度。必要时调整通气和镇静参数。
   注意：生命体征的理想值是 HR 为 130-160 bpm，BP 为 75-95/60-70，spO2 > 85。
5. 用1.5%七氟醚和芬太尼（25-200μg/ kg / min）维持镇静（见 材料表）。
6. 使用直接可视化将导管放置在股动脉 （3 Fr） 和静脉 （4 Fr） 中（参见 材料表）。
   注意：这些导管将用于药物给药和样本采集。因此，保持访问权限非常重要。

2. CPB电路设置和启动

1. 按照以下步骤自定义和设置 CPB 电路（图 3）：
   1. 尽可能缩短管道，同时仍留出足够的距离以到达动物与机器之间的距离。
   2. 创建并连接一个管桥，将膜式氧合器的流出物（参见 材料表）连接到泵的流入物。
      注意：在进行动物的 CA 时，桥对于让血液继续在机器中循环至关重要。
2. 一旦所有连接点都密封，用 300 mL 肝素-盐水溶液（1,000 UI 肝素混合到 1 L 生理盐水中）和 300 mL 新鲜供体猪血灌注回路，然后用 3.5 mEq 碳酸氢钠、350 UI 肝素和 450 mg 葡萄糖酸钙灌注电路（参见 材料表）。
   1. 通过将血液，肝素 - 盐水，碳酸氢钠和葡萄糖酸钙混合物以0.3L / min的速率流过整个回路2分钟来“扫描”回路。

3. 手术和 CPB 启动

注意： 补充图 1 描述了套管放置所需的手术材料。

1. 暴露左颈内静脉和右颈动脉，为插管做准备（图4）。
2. 对于插管，使用 Seldinger 或“过线”技术²¹。
   1. 首先，将针导管插入左颈内静脉。一旦看到血液闪现，小心地将导丝插入血管并取下针头，确保导丝保持在原位。
   2. 将扩张器穿过电线并插入血管，然后取下扩张器。
   3. 在金属丝就位的情况下，穿入一个 8 Fr 静脉套管，然后慢慢将其推进 ~4 cm 进入血管。小心地取下电线，确保套管保持在原位。
   4. 重复 Seldinger 钢丝扩张技术，将 6 Fr 小儿动脉插管（参见 材料表）放入右颈动脉。
   5. 在动脉插管时， 通过 新放置的动脉插管静脉推注肝素 （50 IU/kg）。
3. 一旦达到通路，使用 3-0 聚可吸收缝合线和胶带将两个插管牢固地固定在动物身上，以防止意外移除（图 5）。
4. 将套管连接到 CPB 回路，确保将含肝素的生理盐水添加到连接点，以防止空气进入回路。
5. 将初始流速设置为 80-85 mL/kg/min，然后缓慢增加至 150 mL/kg/min 的极限流速。
   注意：只要实验需要，动物就可以保持在CPB上。步骤 1-3 的架构如 补充图 2 所示。

4. 循环和心脏骤停 （CA）

1. 为了诱导 CA，给予 9 mEq 的 KCl。 使用生命体征评估完全停滞并通过超声心动图确认。必要时管理额外的 KCl。
2. 一旦心脏停止跳动，将动物与回路隔离，以诱导循环停止。
3. 使用先前描述的以 1,500 rpm 循环的桥（步骤 3.5）保持 CPB 电路流量。

5.体外心肺复苏术（eCPR）

1. 一旦达到适当的 CA 条件（0 分钟、30 分钟或 60 分钟），开始 eCPR 复苏。
2. 将仔猪重新连接到 CPB 电路。
3. 通过外周动脉通路给予 3 mL 葡萄糖酸钙（2.25 mmol/10 mL，1：2 稀释）和 6 mL 碳酸氢钠（1 M，1：2 稀释），必要时增加剂量。
   注意：如有必要，可以使用心脏复律或正性肌力药物（肾上腺素或多巴胺）。

6.术后护理

1. 复苏后，监测生命体征 15 分钟以确保稳定性。
   注意：重症监护病房期间的理想参数是：HR 为 100-150 bpm，BP 为 75-95/60-70，spO2 > 85。
2. 转移动物进行磁共振成像（MRI）。
   注意：成像后，动物从未恢复，并且在麻醉下通过静脉注射戊巴比妥钠获得脑样本进行组织学分析而被安乐死。该程序的实验部分的时间表，包括样本收集策略，可以在 补充图3中查看。

结果

在 6 个月的时间里，由儿科重症监护医师、小儿心脏病专家、兽医和技术人员组成的跨学科团队执行了 12 次完整的方案（补充图 2 和 补充图 3）。

图1和 图2 显示了该协议中使用的动物的预期解剖结构。纳入的仔猪平均年龄为4.8日龄（4-6天），平均体重为2,814克（2,400-3,140克）。共有42%是女性。他们都成功?...

讨论

体外循环通常用于成人、儿童和新生儿的心脏手术。它依赖于电动体外回路和膜氧合器，它们共同为血液充氧并提供肺和心脏稳定。先前的研究表明，CPB 可能会对患病和既往健康患者的许多器官系统（肾、脑、肺、心脏、胃肠道）产生不利影响 22,23,24。这可能是由多种因素驱动的，包括动脉脉压下降、血细胞暴露于异物和/或?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted