장기간의 순환 정지 후 체외 심폐 소생술의 소아 동물 모델

요약

이 프로토콜은 심폐 우회술(CPB)의 신생아 돼지 모델을 설명하며, 순환 정지 및 심장 정지를 CPB에 이차적인 심각한 뇌 손상 및 기타 합병증을 연구하기 위한 도구로 사용합니다.

초록

선천성 심장 질환(CHD)은 가장 흔한 선천성 기형으로, 전 세계적으로 매년 약 100만 명의 출산이 영향을 받습니다. 이 질병에 대한 포괄적인 연구는 적절하고 검증된 동물 모델을 필요로 합니다. 새끼 돼지는 유사한 해부학 및 생리학으로 인해 중개 연구에 일반적으로 사용됩니다. 이 연구는 심장 수술의 심각한 뇌 손상 및 기타 합병증을 연구하기 위한 도구로서 순환 및 심장 마비(CA)를 동반한 심폐 우회술(CPB)의 신생아 자돈 모델을 설명하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 자료 목록을 포함하는 것 외에도 이 작업은 다른 조사관이 이 프로토콜을 계획하고 실행할 수 있는 로드맵을 제공합니다. 경험 많은 실무자가 여러 번의 시험을 수행한 후, 모델의 대표적인 결과는 92%의 성공률을 보였으며 실패는 작은 자돈 크기와 변형된 혈관 해부학적 구조에 기인했습니다. 또한 이 모델을 통해 실무자는 CA의 다양한 시간, 온도 변화 및 약리학적 중재를 포함한 다양한 실험 조건 중에서 선택할 수 있었습니다. 요약하면, 이 방법은 대부분의 병원 환경에서 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하고, 신뢰할 수 있고 재현성이 높으며, 심장 수술을 받는 어린이의 중개 연구를 향상시키는 데 널리 사용될 수 있습니다.

서문

선천성 심장 질환(CHD)은 가장 흔한 선천성 기형으로, 전 세계적으로 매년 약 100만 명의 출산이 영향을 받습니다¹. 현대의 흉부외과(CTS)와 집중 치료 기술의 발전으로 사망률이 개선되었지만, 동반 질환은 여전히 매우 흔하다 ^2,3,4,5. 인지 및 운동 장애와 학습 장애를 포함한 신경 발달 이상은 이러한 환자의 약 25%-50%에서 보고됩니다 ^6,7,8. 생후 첫 며칠 동안의 수술, 특히 순환 정지 및 심정지(CA)가 필요한 수술은 이환율을 증가시키는 것으로 입증되었다⁹. 수술 중 혈역학적 변화는 취약한 신생아 뇌 발달에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 실험 모델은 이러한 비정상의 원인을 더 잘 이해하고 이러한 환자의 예후를 개선하기 위한 신경 보호 전략을 조사하는 데 필수적입니다.

이 개체군을 연구하기 위해 동물 모델을 사용하는 것은 널리 문서화되어 있습니다 5,10,11,12,13,14. 특히, 새끼 돼지는 심장 해부학(그림 1), 게놈 및 생리학에서 가까운 근사치를 고려할 뿐만 아니라 다른 동물 모델에 비해 상대적으로 큰 크기를 감안할 때 탁월한 옵션을 제공합니다¹⁵(그림 2). 심폐 우회술(CPB)과 CA의 효과를 연구하기 위해 새끼 돼지 모델을 사용하는 방법은 이전에 설명되었습니다. 이러한 실험 동물 모델은 혈역학적 변화 및 관련 말단 조직 장기 합병증을 연구하는 데 유용합니다 14,16,17,18,19,20. 이러한 모델은 연구원들이 다양한 실험 조건에 대한 유연성을 가지고 통제된 환경에서 인간 조건을 연구할 수 있도록 개발되었습니다. 대부분의 연구는 고급 수술 기술을 요구하고, 더 높은 자원 활용을 요구하며, 장기 생존을 보장하기 어렵게 만드는 기술인 중앙 캐뉼레이션의 사용을 보고합니다. 이전 연구에서 CPB^12,15를 연구하는 데 새끼 돼지를 사용하는 것을 문서화했지만 말초 캐뉼레이션 기술을 제안한 사람은 거의 없습니다.

이 새로운 말초 캐뉼레이션 기법은 발표된 다른 연구와 비교할 때 더 쉽고, 덜 공격적이며, 더 실현 가능하다¹⁹. 더욱이, 신생아 및 소동물에서 이 기술을 검증하는 것은 새로운 일이며, CHD 및 그와 관련된 동반 질환을 연구하기 위해 동물 모델을 사용하는 데 관심이 있는 모든 연구자가 사용을 고려해야 합니다. 동물 모델 실험을 수행한 경험이 있는 물품, 자원 및 인력을 갖춘 실험실에 접근할 수 있는 개인에게 특히 적합합니다.

요약하면, 이 연구의 주요 목적은 CA가 있는 CPB의 신생아 자돈 모델을 설명하고 검증하는 것입니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 조건의 통제된 환경에서 CPB 수술의 심각한 뇌 손상 및 기타 가능한 합병증을 연구하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 일반화할 수 있고 신뢰할 수 있으며 고품질의 모델을 제공하여 다양한 실험 프로토콜에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

본 절차는 카탈로니아 비교 의학 및 생체 이미지 센터(CEEA-CMCiB)의 동물 실험 윤리 위원회(CEEA)의 승인을 받았습니다. 카탈루냐 정부는 또한 실험 프로토콜(번호 11652), 파일 식별 번호 FUE-2022-02381434 및 ID QBXQ3RY3J를 승인했습니다. 감독과 도움을 제공하는 공인 수의사를 포함하여 경험 많은 실무자들이 모든 실험을 수행했습니다. 본 연구에는 생후 4-6일, 체중 2.5-3.5kg의 새끼 돼지(Sus scrofa domestica)가 사용되었습니다. 관련 편향을 피하기 위해 성별 분포의 균형을 맞추려는 시도가 이루어졌습니다.

1. 진정, 삽관 및 접근

1. 근육 주사 케타민(20mg/kg), 덱스메데토미딘(0.02mg/kg) 및 미다졸람(0.3mg/kg)으로 진정 및 진통을 시작합니다. 동물이 깊이 진정되면(사전 약물 투여 후 5분 후) 마스크(2L/min)를 통해 100% O₂ 로 산소를 공급합니다. 다음으로 IV 프로포폴(0.5mg/kg)로 마취를 유도합니다( 재료 표 참조).
2. 새끼 돼지를 등쪽 누운 위치에 놓습니다. 기관을 직접 시각화하여 2.5mm 커프가 있는 기관내관( 재료 표 참조)을 사용하여 구기관 삽관을 수행합니다.
   1. 폐 기저부의 직접 청진을 통해 적절한 기관내관 배치를 확인합니다.
3. 분당 30회의 호흡수, 8-12mL/kg의 일회 호흡량, 4cmH_2O의 호기말 압력을 제공하도록 기계 환기를 설정합니다.
4. 프로토콜 중에 심박수(HR), 혈압(BP) 및 산소 포화도(spO2)를 통해 마취 깊이를 지속적으로 모니터링합니다. 필요에 따라 인공호흡기 및 진정 매개변수를 조정합니다.
   알림: 바이탈의 이상적인 값은 HR 130-160bpm, BP 75-95/60-70, spO2 > 85입니다.
5. 1.5% 세보플루란과 펜타닐(25-200 μg/kg/min)로 진정을 유지합니다( 재료 표 참조).
6. 직접 시각화를 사용하여 대퇴 동맥(3 Fr)과 정맥(4 Fr)에 카테터를 배치합니다( 재료 표 참조).
   참고: 이 카테터는 약물 투여 및 검체 채취에 사용됩니다. 따라서 액세스를 유지하는 것이 중요합니다.

2. CPB 회로 설정 및 프라이밍

1. 아래 단계에 따라 CPB 회로를 사용자 정의하고 설정합니다(그림 3).
   1. 튜브를 가능한 한 줄이면서 기계에서 동물이 도달할 수 있는 충분한 거리를 유지하십시오.
   2. 멤브레인 산소화기( 재료 표 참조)의 유출을 펌프로의 유입과 연결하는 튜브 브리지를 만들고 부착합니다.
      알림: 브리지는 동물의 CA가 수행되는 동안 혈액이 기계를 통해 계속 순환할 수 있도록 하는 데 중요합니다.
2. 모든 연결 지점이 밀봉되면 300mL의 헤파린-식염수(1,000UI의 헤파린을 1L의 식염수에 혼합)와 300mL의 신선한 기증자 돼지 혈액으로 회로를 프라이밍한 다음 3.5mEq 중탄산나트륨, 헤파린 350UI 및 450mg의 글루콘산칼슘을 넣습니다( 재료 표 참조).
   1. 혈액, 헤파린-식염수, 중탄산나트륨 및 글루콘산칼슘 혼합물을 2L/min의 속도로 0.3분 동안 전체 회로를 통과시켜 회로를 "스윕"합니다.

3. 수술 및 CPB 시작

참고: 보충 그림 1 은 캐뉼라 배치에 필요한 수술 재료를 보여줍니다.

1. 캐뉼레이션을 준비하기 위해 좌측 내경정맥과 우측 경동맥을 노출시킵니다(그림 4).
2. 캐뉼레이션의 경우 Seldinger 또는 "over-the-wire" 기술²¹을 사용하십시오.
   1. 먼저 좌측 내경정맥에 바늘 카테터를 삽입합니다. 섬광하는 피가 보이면 가이드 와이어를 혈관에 조심스럽게 삽입하고 바늘을 제거하여 와이어가 제자리에 고정되도록 합니다.
   2. 확장기를 와이어 위로 용기에 끼운 다음 확장기를 제거합니다.
   3. 와이어가 제자리에 있는 상태에서 8 Fr 정맥 캐뉼라를 끼우고 혈관에 ~4cm 천천히 전진시킵니다. 캐뉼라가 제자리에 유지되도록 와이어를 조심스럽게 제거합니다.
   4. 팽창과 함께 Seldinger 와이어 기술을 반복하여 6 Fr 소아 동맥 캐뉼라( 재료 표 참조)를 오른쪽 경동맥에 배치합니다.
   5. 동맥 캐뉼라 삽입 시 새로 배치된 동맥 캐뉼라를 통해 헤파린 정맥 주사(50IU/kg) 볼루스를 투여합니다.
3. 접근이 완료되면 부주의한 제거를 방지하기 위해 3-0 폴리 흡수성 봉합사와 테이프를 사용하여 두 캐뉼라를 동물에 단단히 고정합니다(그림 5).
4. 캐뉼라를 CPB 회로에 연결하고 회로의 공기를 방지하기 위해 헤파린이 함유된 식염수가 연결 지점에 추가되도록 합니다.
5. 초기 유속을 80-85mL/kg/min으로 설정하고 최종 유속인 150mL/kg/min까지 천천히 증가시킵니다.
   참고: 동물은 실험에 필요한 한 CPB에 남아 있을 수 있습니다. 1-3단계의 스키마는 보충 그림 2에 설명되어 있습니다.

4. 순환 및 심장 마비 (CA)

1. CA를 유도하려면 9mEq의 KCl을 투여합니다. 바이탈을 사용하여 완전 정지를 평가하고 심장 초음파로 확인합니다. 필요에 따라 추가 KCl을 관리합니다.
2. 심장이 멈추면 동물을 회로에서 격리시켜 순환 정지를 유도합니다.
3. 앞서 설명한 브리지(3.5rpm에서 순환하는 1,500단계)를 사용하여 CPB 회로 흐름을 유지합니다.

5. 체외 심폐 소생술(eCPR)

1. 적절한 CA 상태(0분, 30분 또는 60분)에 도달하면 eCPR 소생술을 시작합니다.
2. 새끼 돼지를 CPB 회로에 다시 연결합니다.
3. 말초 동맥 접근을 통해 글루콘산칼슘 3mL(2.25mmol/10mL, 1:2 희석) 및 중탄산나트륨(1M, 1:2 희석) 6mL를 투여하고 필요에 따라 용량을 추가합니다.
   참고: 필요한 경우 심장율동전환 또는 수축성 약물(아드레날린 또는 도파민)을 사용할 수 있습니다.

6. 수술 후 관리

1. 소생되면 안정성을 보장하기 위해 15분 동안 바이탈을 모니터링합니다.
   참고: 집중 치료실 기간의 이상적인 매개변수는 HR 100-150bpm, BP 75-95/60-70, spO2 > 85입니다.
2. 자기 공명 영상(MRI)을 위해 동물을 옮깁니다.
   참고: 이미징 후 동물은 회복되지 않았고 조직학적 분석을 위한 뇌 샘플을 얻기 위해 펜토바르비탈 나트륨의 정맥 투여를 통해 마취 상태에서 안락사되었습니다. 샘플 수집 전략을 포함한 절차의 실험 부분의 타임라인은 보충 그림 3에서 볼 수 있습니다.

결과

6개월 동안 소아 중환자 치료 의사, 소아 심장 전문의, 수의사 및 기술자로 구성된 학제 간 팀이 전체 프로토콜을 12회 수행했습니다(보충 그림 2 및 보충 그림 3).

그림 1과 그림 2 는 이 프로토콜에 사용된 동물의 예상 해부학적 구조를 보여줍니다. 포함된 새끼 돼지는 평균 생후 4.8일(4-6일)이었고 평균 무게?...

토론

심폐 우회술은 성인, 어린이 및 신생아의 심장 수술 중에 일반적으로 사용됩니다. 그것은 혈액에 산소를 공급하고 폐 및 심장 안정화를 제공하기 위해 함께 작동하는 전동식 체외 회로와 막 산소 공급기에 의존합니다. 이전 연구에 따르면 CPB는 아픈 환자와 이전에 건강했던 환자 모두에서 많은 장기 시스템(신장, 대뇌, 폐, 심장, 위장)에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 22,23,24....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted