Modello animale pediatrico di rianimazione cardiopolmonare extracorporea dopo arresto circolatorio prolungato

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello suino neonatale di bypass cardiopolmonare (CPB), con arresto circolatorio e cardiaco come strumento per studiare il grave danno cerebrale e altre complicanze secondarie al CPB.

Abstract

La cardiopatia congenita (CHD) è la malformazione congenita più diffusa, con circa un milione di nascite colpite in tutto il mondo ogni anno. Un'indagine completa su questa malattia richiede modelli animali appropriati e convalidati. I suinetti sono comunemente usati per la ricerca traslazionale a causa della loro analoga anatomia e fisiologia. Questo lavoro mirava a descrivere e convalidare un modello neonatale di suinetto di bypass cardiopolmonare (CPB) con arresto circolatorio e cardiaco (CA) come strumento per studiare gravi danni cerebrali e altre complicanze della cardiochirurgia. Oltre a includere un elenco di materiali, questo lavoro fornisce una tabella di marcia per altri ricercatori per pianificare ed eseguire questo protocollo. Dopo che professionisti esperti hanno eseguito diverse prove, i risultati rappresentativi del modello hanno dimostrato un tasso di successo del 92%, con fallimenti attribuiti alle piccole dimensioni dei suinetti e alla variante dell'anatomia dei vasi. Inoltre, il modello ha permesso ai professionisti di scegliere tra un'ampia varietà di condizioni sperimentali, tra cui tempi variabili in CA, alterazioni della temperatura e interventi farmacologici. In sintesi, questo metodo utilizza materiali prontamente disponibili nella maggior parte delle strutture ospedaliere, è affidabile e riproducibile e può essere ampiamente impiegato per migliorare la ricerca traslazionale nei bambini sottoposti a cardiochirurgia.

Introduzione

La cardiopatia congenita (CHD) è la malformazione congenita più diffusa, con circa un milione di nascite colpite in tutto il mondo ogni anno¹. Sebbene i moderni progressi nella chirurgia cardiotoracica (STC) e nel trattamento in terapia intensiva abbiano migliorato i tassi di mortalità, le comorbidità rimangono estremamente comuni 2,3,4,5. Anomalie dello sviluppo neurologico, inclusi disturbi cognitivi e motori e difficoltà di apprendimento, sono riportate in circa il 25%-50% di questi pazienti ^6,7,8. È stato dimostrato che la chirurgia durante i primi giorni di vita, in particolare quelli che richiedono l'arresto circolatorio e cardiaco (CA), aumenta la morbilità⁹. Le alterazioni emodinamiche durante l'intervento chirurgico possono avere un effetto importante sul cervello neonatale vulnerabile in via di sviluppo. I modelli sperimentali sono essenziali per comprendere meglio l'origine di queste anomalie e studiare strategie neuroprotettive per migliorare la prognosi di questi pazienti.

L'uso di modelli animali per studiare questa popolazione è stato ampiamente documentato 5,10,11,12,13,14. In particolare, i suinetti offrono un'opzione eccellente, date le approssimazioni ravvicinate nell'anatomia cardiaca (Figura 1), nel genoma e nella fisiologia, nonché le loro dimensioni relativamente maggiori rispetto ad altri modelli animali¹⁵ (Figura 2). L'uso di modelli di suinetti per studiare gli effetti sia del bypass cardiopolmonare (CPB) che del CA è stato precedentemente descritto. Questi modelli animali sperimentali sono utili per studiare i cambiamenti emodinamici e le complicanze associate agli organi dei tessuti terminali 14,16,17,18,19,20. Questi modelli sono stati sviluppati per consentire ai ricercatori di studiare le condizioni umane in un ambiente controllato, con flessibilità per una varietà di condizioni sperimentali. La maggior parte degli studi riporta l'uso dell'incannulamento centrale, una tecnica che richiede competenze chirurgiche avanzate, richiede un maggiore utilizzo delle risorse e rende difficile garantire la sopravvivenza a lungo termine. Sebbene studi precedenti abbiano documentato l'uso di suinetti nello studio del CPB^12,15, pochi hanno proposto la tecnica dell'incannulamento periferico.

Questa nuova tecnica di incannulamento periferico è più semplice, meno aggressiva e più fattibile rispetto ad altri studi pubblicati¹⁹. Inoltre, la convalida di questa tecnica nei neonati e nei piccoli animali è nuova e dovrebbe essere presa in considerazione per l'uso da parte di tutti i ricercatori interessati a utilizzare un modello animale per studiare la CHD e le sue comorbidità associate. È particolarmente appropriato per le persone che hanno accesso a un laboratorio dotato di forniture, risorse e personale esperto nella conduzione di esperimenti su modelli animali.

In sintesi, l'obiettivo principale di questo studio è quello di descrivere e convalidare un modello di suinetto neonatale di CPB con CA. Il protocollo mira a studiare il grave danno cerebrale e altre possibili complicanze della chirurgia CPB in un contesto controllato con condizioni sperimentali variabili. Questo metodo fornisce un modello generalizzabile, affidabile e di alta qualità, che può essere utilizzato per un'ampia varietà di protocolli sperimentali.

Protocollo

La presente procedura è stata approvata dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale (CEEA) del Centro di Medicina Comparata e Bioimmagine della Catalogna (CEEA-CMCiB). Il governo della Catalogna ha anche autorizzato il protocollo sperimentale (n. 11652), numero di identificazione del file FUE-2022-02381434 e ID QBXQ3RY3J. Professionisti esperti, compresi veterinari certificati che forniscono supervisione e assistenza, hanno eseguito tutti gli esperimenti. Per il presente studio sono stati utilizzati suinetti (Sus scrofa domestica), di 4-6 giorni, del peso di 2,5-3,5 kg. Si è cercato di bilanciare la distribuzione di genere per evitare pregiudizi correlati.

1. Sedazione, intubazione e accesso

1. Iniziare la sedazione e l'analgesia con ketamina intramuscolare (20 mg/kg), dexmedetomidina (0,02 mg/kg) e midazolam (0,3 mg/kg). Una volta che l'animale è profondamente sedato (5 minuti dopo la somministrazione della premedicazione), ossigenarlo con il 100% di O₂ tramite una maschera per il muso (2 L/min). Successivamente, indurre l'anestesia con propofol EV (0,5 mg/kg) (vedi Tabella dei materiali).
2. Posizionare il suinetto in posizione sdraiata dorsale. Eseguire l'intubazione orotracheale utilizzando un tubo endotracheale cuffiato da 2,5 mm (vedere la Tabella dei materiali), utilizzando la visualizzazione diretta della trachea.
   1. Confermare il corretto posizionamento del tubo endotracheale tramite auscultazione diretta delle basi polmonari.
3. Impostare la ventilazione meccanica in modo che fornisca una frequenza respiratoria di 30 respiri al minuto, un volume corrente di 8-12 mL/kg e una pressione di fine espirazione di 4 cmH₂O.
4. Monitorare continuamente la profondità dell'anestesia durante il protocollo tramite frequenza cardiaca (FC), pressione sanguigna (BP) e saturazione di ossigeno (spO2). Regolare i parametri di ventilazione e sedazione secondo necessità.
   NOTA: I valori ideali per i parametri vitali sono una HR di 130-160 bpm, una pressione arteriosa di 75-95/60-70 e una spO2 > 85.
5. Mantenere la sedazione con sevoflurano all'1,5% e fentanil (25-200 μg/kg/min) (vedi Tabella dei materiali).
6. Utilizzare la visualizzazione diretta per posizionare i cateteri nell'arteria femorale (3 Fr) e nella vena (4 Fr) (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Questi cateteri verranno utilizzati per la somministrazione di farmaci e l'acquisizione di campioni. Pertanto, è importante mantenere l'accesso.

2. Configurazione e adescamento del circuito CPB

1. Personalizza e configura il circuito CPB seguendo i passaggi seguenti (Figura 3):
   1. Accorciare il più possibile il tubo, lasciando comunque una distanza sufficiente per raggiungere l'animale dalla macchina.
   2. Creare e collegare un ponte di tubi che colleghi il deflusso dall'ossigenatore a membrana (vedi Tabella dei materiali) all'afflusso nella pompa.
      NOTA: Il ponte è fondamentale per consentire al sangue di continuare a circolare attraverso la macchina durante l'esecuzione delle CA dell'animale.
2. Una volta sigillati tutti i punti di connessione, innescare il circuito con 300 mL di una soluzione eparina-salina (1.000 UI di eparina miscelata in 1 L di soluzione fisiologica) e 300 mL di sangue fresco di suino donato, seguiti da 3,5 mEq di bicarbonato di sodio, 350 UI di eparina e 450 mg di gluconato di calcio (vedi Tabella dei materiali).
   1. "Spazzare" il circuito facendo scorrere la miscela di sangue, eparina-soluzione salina, bicarbonato di sodio e gluconato di calcio attraverso l'intero circuito per 2 minuti a una velocità di 0,3 L/min.

3. Chirurgia e iniziazione del CPB

NOTA: La Figura 1 supplementare illustra i materiali chirurgici necessari per il posizionamento della cannula.

1. Esporre la vena giugulare interna sinistra e l'arteria carotide destra per prepararsi all'incannulamento (Figura 4).
2. Per l'incannulamento, utilizzare la tecnica di Seldinger o "over-the-wire"²¹.
   1. Innanzitutto, inserire un ago catetere nella vena giugulare interna sinistra. Una volta visualizzato un lampo di sangue, inserire con cautela un filo guida nel vaso e rimuovere l'ago, assicurandosi che il filo rimanga in posizione.
   2. Infilare un dilatatore sul filo e nel recipiente, quindi rimuovere il dilatatore.
   3. Con il filo ancora in posizione, infilare una cannula venosa da 8 Fr e farla avanzare lentamente di ~4 cm nel vaso. Rimuovere con cautela il filo, assicurandosi che la cannula rimanga in posizione.
   4. Ripetere la tecnica del filo di Seldinger con dilatazione per posizionare una cannula arteriosa pediatrica da 6 Fr (vedi Tabella dei materiali) nell'arteria carotide destra.
   5. Al momento dell'incannulamento arterioso, somministrare un bolo di eparina per via endovenosa (50 UI/kg) attraverso la cannula arteriosa appena posizionata.
3. Una volta ottenuto l'accesso, fissare saldamente entrambe le cannule all'animale utilizzando suture e nastro riassorbibile 3-0 per evitare la rimozione involontaria (Figura 5).
4. Collegare le cannule al circuito CPB, assicurandosi che la soluzione fisiologica con eparina venga aggiunta ai punti di connessione per evitare l'ingresso di aria nel circuito.
5. Impostare il flusso iniziale a 80-85 mL/kg/min e aumentarlo lentamente fino a una portata finale di 150 mL/kg/min.
   NOTA: L'animale può rimanere sul CPB per tutto il tempo richiesto dagli esperimenti. Uno schema dei passaggi 1-3 è illustrato nella Figura 2 supplementare.

4. Arresto circolatorio e cardiaco (CA)

1. Per indurre la CA, somministrare 9 mEq di KCl. Utilizzare i parametri vitali per valutare l'arresto completo e confermare con l'ecocardiografia. Somministrare KCl aggiuntivo se necessario.
2. Una volta che il cuore si è fermato, isolare l'animale dal circuito per indurre l'arresto circolatorio.
3. Mantenere il flusso del circuito CPB utilizzando il ponte precedentemente descritto (passaggio 3.5) che circola a 1.500 giri/min.

5. Rianimazione cardiopolmonare extracorporea (eCPR)

1. Una volta raggiunta la condizione di CA appropriata (0 min, 30 min o 60 min), iniziare la rianimazione eCPR.
2. Ricollegare il suinetto al circuito CPB.
3. Somministrare 3 mL di gluconato di calcio (2,25 mmol/10 mL, diluito 1:2) e 6 mL di bicarbonato di sodio (1 M, diluito 1:2) attraverso l'accesso arterioso periferico, aggiungendo dosi se necessario.
   NOTA: Se necessario, possono essere utilizzati cardioversione o farmaci inotropi (adrenalina o dopamina).

6. Assistenza postoperatoria

1. Una volta rianimato, monitorare i parametri vitali per 15 minuti per garantire la stabilità.
   NOTA: I parametri ideali nel periodo dell'unità di terapia intensiva sono: HR di 100-150 bpm, BP di 75-95/60-70 e spO2 > 85.
2. Trasferire gli animali per la risonanza magnetica (MRI).
   NOTA: Dopo l'imaging, gli animali non si sono mai ripresi e sono stati soppressi mentre erano sotto anestesia tramite somministrazione endovenosa di pentobarbital sodico per ottenere campioni di cervello per l'analisi istologica. Una cronologia della parte sperimentale della procedura, inclusa la strategia di raccolta del campione, può essere visualizzata nella Figura 3 supplementare.

Risultati

Durante un periodo di 6 mesi, il protocollo completo è stato eseguito 12 volte da un team interdisciplinare di medici di terapia intensiva pediatrica, cardiologi pediatrici, veterinari e tecnici (Figura 2 e Figura 3 supplementare).

La Figura 1 e la Figura 2 dimostrano l'anatomia prevista degli animali utilizzati in questo protocollo. I suinetti inclusi avevano in media 4,8 giorni (4-6 giorni) e pesav...

Discussione

Il bypass cardiopolmonare è comunemente usato durante la cardiochirurgia per adulti, bambini e neonati. Si basa su un circuito extracorporeo motorizzato e un ossigenatore a membrana che lavorano insieme per ossigenare il sangue e fornire stabilizzazione polmonare e cardiaca. Studi precedenti hanno dimostrato che il CPB può avere un impatto negativo su molti sistemi di organi (renale, cerebrale, polmonare, cardiaco, gastrointestinale) sia in pazienti malati che precedentemente sani 22,23,24.^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted