Педиатрическая животная модель экстракорпоральной сердечно-легочной реанимации после длительной остановки кровообращения

Резюме

В этом протоколе описывается неонатальная модель искусственного кровообращения (ИКЛ) у свиней с остановкой кровообращения и сердца в качестве инструмента для изучения тяжелых повреждений головного мозга и других осложнений, вторичных по отношению к ИКЛ.

Аннотация

Врожденный порок сердца (ВПС) является наиболее распространенным врожденным пороком развития, ежегодно во всем мире рождается около миллиона детей. Для всестороннего исследования этого заболевания требуются соответствующие и проверенные модели на животных. Поросята обычно используются для трансляционных исследований из-за их аналогичной анатомии и физиологии. Целью данной работы было описать и валидировать модель искусственного кровообращения (ИКБ) у неонатального поросенка с остановкой кровообращения и сердца (КА) в качестве инструмента для изучения тяжелых повреждений головного мозга и других осложнений кардиохирургии. В дополнение к включению перечня материалов, эта работа предоставляет дорожную карту для других следователей для планирования и выполнения этого протокола. После того, как опытные практикующие врачи провели несколько испытаний, репрезентативные результаты модели продемонстрировали 92% успеха, при этом неудачи были связаны с маленьким размером поросенка и вариантом анатомии сосуда. Кроме того, модель позволяла практикующим врачам выбирать из широкого спектра экспериментальных условий, включая различное время КА, изменения температуры и фармакологические вмешательства. Таким образом, этот метод использует материалы, легко доступные в большинстве больниц, является надежным и воспроизводимым, а также может широко использоваться для улучшения трансляционных исследований у детей, перенесших операции на сердце.

Введение

Врожденный порок сердца (ВПС) является наиболее распространенным врожденным пороком развития, ежегодно во всем мире происходит около миллиона^родов. Несмотря на то, что современные достижения в области кардиоторакальной хирургии (КТС) и интенсивной терапии позволили снизить уровень смертности, сопутствующие заболевания остаются чрезвычайно распространенными 2,3,4,5. Аномалии развития нервной системы, включая когнитивные и двигательные нарушения, а также трудности в обучении, отмечаются примерно у 25-50% этих пациентов ^6,7,8. Было продемонстрировано, что хирургическое вмешательство в первые дни жизни, особенно те, которые требуют остановки кровообращения и сердца (КА), увеличивает заболеваемость⁹. Гемодинамические изменения во время хирургического вмешательства могут оказать важное влияние на уязвимый развивающийся мозг новорожденного. Экспериментальные модели необходимы для лучшего понимания происхождения этих аномалий и изучения нейропротекторных стратегий для улучшения прогнозов этих пациентов.

Использование животных моделей для изучения этой популяции было широко задокументировано 5,10,11,12,13,14. Примечательно, что поросята представляют собой отличный вариант, учитывая близкое приближение в анатомии сердца (рис. 1), геноме и физиологии, а также их относительно большие размеры по сравнению с другими животными моделями¹⁵ (рис. 2). Ранее было описано использование моделей поросят для изучения эффектов как сердечно-легочного шунтирования (ИКБ), так и КА. Эти экспериментальные животные модели полезны для изучения гемодинамических изменений и связанных с ними осложнений со стороны органов-конечных тканей 14,16,17,18,19,20. Эти модели были разработаны для того, чтобы позволить исследователям изучать условия жизни человека в контролируемых условиях, с гибкостью для различных экспериментальных условий. В большинстве исследований сообщается об использовании центральной канюляции, метода, который требует передовых хирургических навыков, требует более эффективного использования ресурсов и затрудняет обеспечение долгосрочной выживаемости. Хотя предыдущие исследования документально подтвердили использование поросят в изучении CPB^12,15, лишь немногие предложили технику периферической канюляции.

Этот новый метод периферической канюляции является более простым, менее агрессивным и более осуществимым по сравнению с другими^{опубликованными} исследованиями. Более того, валидация этого метода на новорожденных и мелких животных является новой и должна быть рассмотрена для использования всеми исследователями, заинтересованными в использовании животной модели для изучения ИБС и связанных с ней сопутствующих заболеваний. Это особенно подходит для лиц, имеющих доступ к лаборатории, оснащенной материалами, ресурсами и персоналом, имеющим опыт проведения экспериментов на животных моделях.

Таким образом, основной целью данного исследования является описание и валидация модели ИКЛ у неонатального поросенка с КА. Протокол направлен на изучение тяжелых повреждений головного мозга и других возможных осложнений хирургии искусственного кровообращения в контролируемых условиях с различными экспериментальными условиями. Этот метод обеспечивает обобщенную, надежную и высококачественную модель, которая может быть использована для широкого спектра экспериментальных протоколов.

протокол

Данная процедура была одобрена Комитетом по этике экспериментов на животных (CEEA) Центра сравнительной медицины и биоимиджа Каталонии (CEEA-CMCiB). Правительство Каталонии также санкционировало экспериментальный протокол (No 11652), идентификационный номер файла FUE-2022-02381434 и удостоверение личности QBXQ3RY3J. Все эксперименты проводили опытные практикующие врачи, в том числе сертифицированные ветеринарные врачи, обеспечивающие наблюдение и помощь. Для настоящего исследования использовали поросят (Sus scrofa domestica) в возрасте 4-6 дней, массой тела 2,5-3,5 кг. Была предпринята попытка сбалансировать гендерное распределение, чтобы избежать связанных с этим предубеждений.

1. Седация, интубация и доступ

1. Начните введение седативного эффекта и обезболивания с помощью внутримышечного введения кетамина (20 мг/кг), дексмедетомидина (0,02 мг/кг) и мидазолама (0,3 мг/кг). После того, как животное будет глубоко усыплено (через 5 минут после введения премедикации), насытитесь кислородом со 100_{% О2} через маску для морды (2 л/мин). Далее вызывают анестезию внутривенно пропофолом (0,5 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
2. Расположите поросенка в положении спинного лежания. Выполняйте оротрахеальную интубацию с помощью эндотрахеальной трубки с манжетой диаметром 2,5 мм (см. Таблицу материалов), используя прямую визуализацию трахеи.
   1. Подтвердите правильную установку эндотрахеальной трубки путем прямой аускультации оснований легких.
3. Установите искусственную вентиляцию легких таким образом, чтобы частота дыхания составляла 30 вдохов в минуту, дыхательный объем составлял 8-12 мл/кг, а давление в конце выдоха составляло 4 смH₂O.
4. Непрерывно контролируйте глубину анестезии во время протокола с помощью частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД) и сатурации кислорода (spO2). При необходимости отрегулируйте параметры вентиляции и седации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальными значениями для жизненно важных показателей являются ЧСС 130-160 уд/мин, АД 75-95/60-70 и spO2 > 85.
5. Поддерживать седативный эффект 1,5% севофлураном и фентанилом (25-200 мкг/кг/мин) (см. Таблицу материалов).
6. Используйте прямую визуализацию для установки катетеров в бедренную артерию (3 Fr) и вену (4 Fr) (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти катетеры будут использоваться для введения лекарств и взятия образцов. Таким образом, важно поддерживать доступ.

2. Настройка цепи CPB и заливка

1. Настройте и настройте цепь CPB, выполнив следующие действия (рис. 3):
   1. Укоротите трубку как можно больше, сохраняя при этом достаточное расстояние, чтобы добраться до животного из машины.
   2. Создайте и прикрепите трубчатый мост, который соединяет отток из мембранного оксигенатора (см. Таблицу материалов) с притоком в насос.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мост жизненно важен для того, чтобы кровь продолжала циркулировать по аппарату во время выполнения КА животного.
2. После того, как все точки подключения будут запечатаны, заправьте цепь 300 мл гепариново-физиологического раствора (1000 ЕД гепарина, смешанного с 1 л физиологического раствора) и 300 мл свежей донорской крови свиньи, а затем 3,5 мг бикарбоната натрия, 350 ЕД гепарина и 450 мг глюконата кальция (см. Таблицу материалов).
   1. «Проверьте» контур, пропуская кровь, гепарин-физиологический раствор, бикарбонат натрия и смесь глюконата кальция по всему контуру в течение 2 минут со скоростью 0,3 л/мин.

3. Хирургическое вмешательство и начало искусственного кровообращения

ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 1 изображены хирургические материалы, необходимые для установки канюли.

1. Обнажите левую внутреннюю яремную вену и правую сонную артерию, чтобы подготовиться к канюляции (Рисунок 4).
2. Для канюляции используют метод Сельдингера или технику «over-the-wire»²¹.
   1. Сначала введите игольчатый катетер в левую внутреннюю яремную вену. Как только вспышка крови будет визуализирована, осторожно вставьте направляющую проволоку в сосуд и извлеките иглу, убедившись, что проволока остается на месте.
   2. Проденьте расширитель на проволоку и введите его в сосуд, затем снимите расширитель.
   3. Не снимая проволоку, проденьте венозную канюлю на 8 Fr и медленно продвигайте ее на ~4 см внутрь сосуда. Осторожно снимите провод, убедившись, что канюля остается на месте.
   4. Повторите технику проволоки Сельдингера с дилатацией, чтобы поместить детскую артериальную канюлю 6 Fr (см. Таблицу материалов) в правую сонную артерию.
   5. Во время артериальной канюляции введите болюсное внутривенное введение гепарина (50 МЕ/кг) через вновь установленную артериальную канюлю.
3. Как только доступ будет достигнут, надежно зафиксируйте обе канюли на животном с помощью полирассасывающихся швов 3-0 и пластыря для предотвращения случайного удаления (Рисунок 5).
4. Подключите канюли к цепи CPB, убедившись, что в точки подключения добавлен физиологический раствор с гепарином для предотвращения попадания воздуха в контур.
5. Установите начальный расход на 80-85 мл/кг/мин и медленно увеличивайте его до предельного расхода 150 мл/кг/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное может оставаться на КПБ столько, сколько требуется для проведения экспериментов. Схема шагов 1-3 изображена на дополнительном рисунке 2.

4. Остановка кровообращения и сердца (КА)

1. Чтобы вызвать КА, введите 9 mEq KCl. Используйте жизненно важные показатели для оценки полного ареста и подтверждения с помощью эхокардиографии. При необходимости вводите дополнительный KCl.
2. Как только сердце остановлено, изолируйте животное от цепи, чтобы вызвать остановку кровообращения.
3. Поддерживайте поток в контуре CPB с помощью ранее описанного моста (шаг 3.5), циркулирующего со скоростью 1 500 об/мин.

5. Экстракорпоральная сердечно-легочная реанимация (ЭСЛР)

1. Как только будет достигнуто соответствующее состояние КА (0 мин, 30 мин или 60 мин), начните реанимацию eCPR.
2. Снова подключите поросенка к цепи CPB.
3. Вводите 3 мл глюконата кальция (2,25 ммоль/10 мл, разбавленный 1:2) и 6 мл бикарбоната натрия (1 М, разбавленный 1:2) через периферический артериальный доступ, добавляя дозы по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости можно использовать кардиоверсию или инотропные препараты (адреналин или допамин).

6. Послеоперационный уход

1. После реанимации следите за жизненно важными показателями в течение 15 минут, чтобы обеспечить стабильность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальными параметрами в период интенсивной терапии являются: ЧСС 100-150 уд/мин, АД 75-95/60-70 и spO2 > 85.
2. Переведите животных на магнитно-резонансную томографию (МРТ).
   Примечание: После визуализации животные так и не пришли в себя и были усыплены во время анестезии путем внутривенного введения пентобарбитала натрия для получения образцов мозга для гистологического анализа. График экспериментальной части процедуры, включая стратегию сбора образцов, можно посмотреть на дополнительном рисунке 3.

Результаты

В течение 6-месячного периода полный протокол был выполнен 12 раз междисциплинарной командой педиатров-реаниматологов, детских кардиологов, ветеринаров и техников (Дополнительный рисунок 2 и Дополнительный рисунок 3).

Рисунки 1 и

Обсуждение

Сердечно-легочное шунтирование обычно используется во время кардиохирургии у взрослых, детей и новорожденных. Он основан на моторизованном экстракорпоральном контуре и мембранном оксигенаторе, которые работают вместе, насыщая кровь кислородом и обеспечивая легочную и сердечную ста?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted