Modelo Animal Pediátrico de Ressuscitação Cardiopulmonar Extracorpórea Após Parada Circulatória Prolongada

Resumo

Este protocolo descreve um modelo neonatal de circulação extracorpórea (CEC), com parada circulatória e cardíaca como ferramenta para o estudo de danos cerebrais graves e outras complicações secundárias à CEC.

Resumo

A cardiopatia congênita (DCC) é a malformação congênita mais prevalente, com cerca de um milhão de nascimentos impactados em todo o mundo por ano. A investigação abrangente desta doença requer modelos animais apropriados e validados. Os leitões são comumente usados para pesquisa translacional devido à sua anatomia e fisiologia análogas. Este trabalho teve como objetivo descrever e validar um modelo de circulação extracorpórea (CEC) em leitões neonatais com parada circulatória e cardíaca (PCR) como ferramenta para o estudo de danos cerebrais graves e outras complicações da cirurgia cardíaca. Além de incluir uma lista de materiais, este trabalho fornece um roteiro para outros investigadores planejarem e executarem este protocolo. Depois que profissionais experientes realizaram vários ensaios, os resultados representativos do modelo demonstraram uma taxa de sucesso de 92%, com falhas atribuídas ao pequeno tamanho do leitão e à anatomia variante do vaso. Além disso, o modelo permitiu que os profissionais selecionassem entre uma ampla variedade de condições experimentais, incluindo tempos variados em AC, alterações de temperatura e intervenções farmacológicas. Em resumo, esse método usa materiais prontamente disponíveis na maioria dos ambientes hospitalares, é confiável e reprodutível e pode ser amplamente empregado para aprimorar a pesquisa translacional em crianças submetidas a cirurgia cardíaca.

Introdução

A cardiopatia congênita (CC) é a malformação congênita mais prevalente, com cerca de um milhão de nascimentos impactados em todo o mundo por ano¹. Embora os avanços modernos na cirurgia cardiotorácica (STC) e no tratamento intensivo tenham melhorado as taxas de mortalidade, as comorbidades permanecem extremamente comuns 2,3,4,5. Anormalidades do neurodesenvolvimento, incluindo deficiências cognitivas e motoras, bem como dificuldades de aprendizagem, são relatadas em cerca de 25% a 50% desses pacientes ^6,7,8. A cirurgia nos primeiros dias de vida, especialmente aquelas que requerem parada circulatória e cardíaca (PCR), demonstrou aumentar a morbidade⁹. Alterações hemodinâmicas durante a cirurgia podem ter um efeito importante no cérebro vulnerável do recém-nascido em desenvolvimento. Modelos experimentais são essenciais para entender melhor a origem dessas anormalidades e investigar estratégias neuroprotetoras para melhorar o prognóstico desses pacientes.

O uso de modelos animais para estudar essa população tem sido amplamente documentado 5,10,11,12,13,14. Notavelmente, os leitões oferecem uma excelente opção, dadas as aproximações na anatomia cardíaca (Figura 1), genoma e fisiologia, bem como seu tamanho relativamente maior em comparação com outros modelos animais¹⁵ (Figura 2). O uso de modelos de leitões para estudar os efeitos da circulação extracorpórea (CEC) e da AC foi descrito anteriormente. Esses modelos animais experimentais são úteis para estudar alterações hemodinâmicas e complicações associadas em órgãos de tecido-alvo 14,16,17,18,19,20. Esses modelos foram desenvolvidos para permitir que os pesquisadores estudem as condições humanas em um ambiente controlado, com flexibilidade para uma variedade de condições experimentais. A maioria dos estudos relata o uso da canulação central, técnica que exige habilidades cirúrgicas avançadas, requer maior utilização de recursos e dificulta a garantia de sobrevida em longo prazo. Embora estudos anteriores tenham documentado o uso de leitões no estudo da CEC^12,15, poucos propuseram a técnica de canulação periférica.

Essa nova técnica de canulação periférica é mais fácil, menos agressiva e mais viável quando comparada a outros estudos^publicados19. Além disso, a validação dessa técnica em recém-nascidos e pequenos animais é nova e deve ser considerada para uso por todos os pesquisadores interessados em usar um modelo animal para estudar CC e suas comorbidades associadas. É particularmente apropriado para indivíduos com acesso a um laboratório equipado com suprimentos, recursos e pessoal experiente na realização de experimentos com modelos animais.

Em resumo, o objetivo principal deste estudo é descrever e validar um modelo de leitões neonatais de CEC com AC. O protocolo visa estudar danos cerebrais graves e outras possíveis complicações da cirurgia de CEC em um ambiente controlado com condições experimentais variadas. Este método fornece um modelo generalizável, confiável e de alta qualidade, que pode ser usado para uma ampla variedade de protocolos experimentais.

Protocolo

O presente procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) do Centro de Medicina Comparada e Bioimagem da Catalunha (CEEA-CMCiB). O Governo da Catalunha também autorizou o protocolo experimental (nº 11652), número de identificação do arquivo FUE-2022-02381434 e ID QBXQ3RY3J. Profissionais experientes, incluindo veterinários certificados que fornecem supervisão e assistência, realizaram todos os experimentos. Leitões (Sus scrofa domestica), com 4-6 dias de idade, pesando 2,5-3,5 kg, foram utilizados para o presente estudo. Foi feita uma tentativa de equilibrar a distribuição de gênero para evitar vieses relacionados.

1. Sedação, intubação e acesso

1. Inicie a sedação e analgesia com cetamina intramuscular (20 mg / kg), dexmedetomidina (0,02 mg / kg) e midazolam (0,3 mg / kg). Uma vez que o animal esteja profundamente sedado (5 minutos após a administração da pré-medicação), oxigenar com 100% O₂ através de uma máscara de focinho (2 L/min). Em seguida, induza a anestesia com propofol IV (0,5 mg / kg) (ver Tabela de Materiais).
2. Posicione o leitão na posição de decúbito dorsal. Realize a intubação orotraqueal usando um tubo endotraqueal com balonete de 2,5 mm (consulte a Tabela de Materiais), usando visualização direta da traqueia.
   1. Confirme a colocação apropriada do tubo endotraqueal por meio da ausculta direta das bases pulmonares.
3. Defina a ventilação mecânica para fornecer uma frequência respiratória de 30 respirações por minuto, um volume corrente de 8-12 mL/kg e uma pressão expiratória final de 4 cmH₂O.
4. Monitore continuamente a profundidade da anestesia durante o protocolo por meio da frequência cardíaca (FC), pressão arterial (PA) e saturação de oxigênio (spO2). Ajuste os parâmetros ventilatórios e de sedação conforme necessário.
   NOTA: Os valores ideais para os sinais vitais são FC de 130-160 bpm, PA de 75-95/60-70 e spO2 > 85.
5. Mantenha a sedação com sevoflurano e fentanil a 1,5% (25-200 μg/kg/min) (ver Tabela de Materiais).
6. Use a visualização direta para colocar cateteres na artéria femoral (3 Fr) e na veia (4 Fr) (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Esses cateteres serão usados para administração de medicamentos e aquisição de amostras. Como tal, é importante manter o acesso.

2. Configuração e preparação do circuito CPB

1. Personalize e configure o circuito de PCB seguindo as etapas abaixo (Figura 3):
   1. Encurte o tubo o máximo possível, deixando distância suficiente para alcançar o animal da máquina.
   2. Crie e conecte uma ponte de tubulação que conecte o fluxo de saída do oxigenador de membrana (consulte a Tabela de Materiais) ao fluxo de entrada na bomba.
      NOTA: A ponte é vital para permitir que o sangue continue circulando pela máquina enquanto os CAs do animal estão sendo realizados.
2. Uma vez que todos os pontos de conexão estejam selados, prepare o circuito com 300 mL de uma solução salina de heparina (1.000 UI de heparina misturada em 1 L de solução salina) e 300 mL de sangue de porco doador fresco, seguido por 3,5 mEq de bicarbonato de sódio, 350 UI de heparina e 450 mg de gluconato de cálcio (ver Tabela de Materiais).
   1. "Varra" o circuito passando a mistura de sangue, heparina-salina, bicarbonato de sódio e gluconato de cálcio por todo o circuito por 2 minutos a uma taxa de 0,3 L/min.

3. Cirurgia e início da CEC

NOTA: A Figura 1 suplementar mostra os materiais cirúrgicos necessários para a colocação da cânula.

1. Expor a veia jugular interna esquerda e a artéria carótida direita para preparar a canulação (Figura 4).
2. Para a canulação, utilizar a técnica de Seldinger ou "over-the-wire"²¹.
   1. Primeiro, insira um cateter de agulha na veia jugular interna esquerda. Assim que um flash de sangue for visualizado, insira cuidadosamente um fio-guia no vaso e remova a agulha, garantindo que o fio permaneça no lugar.
   2. Passe um dilatador sobre o fio e no vaso e, em seguida, remova o dilatador.
   3. Com o fio ainda no lugar, enfie uma cânula venosa de 8 Fr e avance-a lentamente ~4 cm para dentro do vaso. Remova cuidadosamente o fio, garantindo que a cânula permaneça no lugar.
   4. Repita a técnica do fio de Seldinger com dilatação para colocar uma cânula arterial pediátrica de 6 Fr (ver Tabela de Materiais) na artéria carótida direita.
   5. No momento da canulação arterial, administre um bolus de heparina intravenosa (50 UI/kg) através da cânula arterial recém-colocada.
3. Uma vez obtido o acesso, fixe com segurança ambas as cânulas ao animal usando suturas poliabsorvíveis 3-0 e fita adesiva para evitar a remoção inadvertida (Figura 5).
4. Conecte as cânulas ao circuito de CEC, garantindo que solução salina com heparina seja adicionada aos pontos de conexão para evitar a entrada de ar no circuito.
5. Defina o fluxo inicial para 80-85 mL / kg / min e aumente-o lentamente para uma taxa de fluxo final de 150 mL / kg / min.
   NOTA: O animal pode permanecer na CEC pelo tempo que os experimentos exigirem. Um esquema das etapas 1 a 3 é representado na Figura Suplementar 2.

4. Parada circulatória e cardíaca (CA)

1. Para induzir CA, administre 9 mEq de KCl. Use sinais vitais para avaliar a parada completa e confirme com ecocardiografia. Administre KCl adicional conforme necessário.
2. Uma vez que o coração esteja parado, isole o animal do circuito para induzir a parada circulatória.
3. Mantenha o fluxo do circuito de CEC usando a ponte descrita anteriormente (etapa 3.5) circulando a 1.500 rpm.

5. Ressuscitação cardiopulmonar extracorpórea (eCPR)

1. Assim que a condição de AC apropriada (0 min, 30 min ou 60 min) for alcançada, inicie a ressuscitação com eCPR.
2. Reconecte o leitão ao circuito de CEC.
3. Administrar 3 mL de gluconato de cálcio (2,25 mmol/10 mL, diluído 1:2) e 6 mL de bicarbonato de sódio (1 M, diluído 1:2) via acesso arterial periférico, adicionando doses conforme necessário.
   NOTA: Cardioversão ou drogas inotrópicas (adrenalina ou dopamina) podem ser usadas, se necessário.

6. Cuidados pós-operatórios

1. Uma vez ressuscitado, monitore os sinais vitais por 15 minutos para garantir a estabilidade.
   NOTA: Os parâmetros ideais no período da unidade de terapia intensiva são: FC de 100-150 bpm, PA de 75-95/60-70 e spO2 > 85.
2. Transfira os animais para ressonância magnética (MRI).
   NOTA: Após a imagem, os animais nunca se recuperaram e foram sacrificados sob anestesia por meio da administração intravenosa de pentobarbital sódico para obtenção de amostras cerebrais para análise histológica. Uma linha do tempo da parte experimental do procedimento, incluindo a estratégia de coleta de amostras, pode ser visualizada na Figura Suplementar 3.

Resultados

Durante um período de 6 meses, o protocolo completo foi realizado 12 vezes por uma equipe interdisciplinar de médicos intensivistas pediátricos, cardiologistas pediátricos, veterinários e técnicos (Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).

A Figura 1 e a Figura 2 demonstram a anatomia esperada dos animais utilizados neste protocolo. Os leitões incluídos tinham em média 4,8 dias de idade (...

Discussão

A circulação extracorpórea é comumente usada durante a cirurgia cardíaca para adultos, crianças e neonatos. Ele conta com um circuito extracorpóreo motorizado e um oxigenador de membrana que trabalham juntos para oxigenar o sangue e fornecer estabilização pulmonar e cardíaca. Estudos anteriores demonstraram que a CEC pode afetar adversamente muitos sistemas de órgãos (renal, cerebral, pulmonar, cardíaco, gastrointestinal) tanto em pacientes doentes quanto em pacientes previamente saudáveis^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted