Uzun Süreli Dolaşım Durması Sonrası Ekstrakorporeal Kardiyopulmoner Resüsitasyonun Pediatrik Hayvan Modeli

Özet

Bu protokol, ciddi beyin hasarı ve CPB'ye ikincil diğer komplikasyonları incelemek için bir araç olarak dolaşım ve kalp durması ile bir yenidoğan domuz kardiyopulmoner baypas (CPB) modelini tanımlar.

Özet

Konjenital kalp hastalığı (KKH) en sık görülen konjenital malformasyondur ve dünya çapında yılda yaklaşık bir milyon doğum etkilenmektedir. Bu hastalığın kapsamlı bir şekilde araştırılması, uygun ve onaylanmış hayvan modelleri gerektirir. Domuz yavruları, benzer anatomileri ve fizyolojileri nedeniyle translasyonel araştırmalar için yaygın olarak kullanılır. Bu çalışma, ciddi beyin hasarı ve kalp cerrahisinin diğer komplikasyonlarını incelemek için bir araç olarak dolaşım ve kardiyak arrest (CA) ile kardiyopulmoner baypasın (CPB) yenidoğan domuz yavrusu modelini tanımlamayı ve doğrulamayı amaçladı. Bu çalışma, bir malzeme listesi eklemenin yanı sıra, diğer araştırmacıların bu protokolü planlaması ve yürütmesi için bir yol haritası sağlar. Deneyimli uygulayıcılar birkaç deneme yaptıktan sonra, modelin temsili sonuçları, küçük domuz yavrusu boyutuna ve varyant damar anatomisine atfedilen başarısızlıklarla birlikte% 92'lik bir başarı oranı gösterdi. Ayrıca model, uygulayıcıların CA'da değişen süreler, sıcaklık değişiklikleri ve farmakolojik müdahaleler dahil olmak üzere çok çeşitli deneysel koşullar arasından seçim yapmalarına izin verdi. Özetle, bu yöntem çoğu hastane ortamında kolayca bulunabilen, güvenilir ve tekrarlanabilir materyalleri kullanır ve kalp ameliyatı geçiren çocuklarda translasyonel araştırmaları geliştirmek için yaygın olarak kullanılabilir.

Giriş

Konjenital kalp hastalığı (KKH) en yaygın konjenital malformasyondur ve dünya çapında yılda yaklaşık bir milyon doğum etkilenmektedir¹. Kardiyotorasik cerrahi (KTS) ve yoğun bakım tedavisindeki modern gelişmeler mortalite oranlarını iyileştirmiş olsa da, komorbiditeler son derece yaygın olmaya devam etmektedir 2,3,4,5. Bilişsel ve motor bozuklukların yanı sıra öğrenme güçlükleri de dahil olmak üzere nörogelişimsel anormallikler bu hastaların yaklaşık %25-50'sinde bildirilmiştir ^6,7,8. Yaşamın ilk günlerinde, özellikle dolaşım ve kardiyak arrest (CA) gerektiren cerrahi ameliyatların morbiditeyi arttırdığı gösterilmiştir⁹. Ameliyat sırasındaki hemodinamik değişiklikler, gelişmekte olan hassas yenidoğan beyni üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Deneysel modeller, bu anormalliklerin kökenini daha iyi anlamak ve bu hastaların prognozlarını iyileştirmek için nöroprotektif stratejileri araştırmak için gereklidir.

Bu popülasyonu incelemek için hayvan modellerinin kullanımı geniş çapta belgelenmiştir 5,10,11,12,13,14. Özellikle, domuz yavruları, kardiyak anatomi (Şekil 1), genom ve fizyolojideki yakın yaklaşımların yanı sıra diğer hayvan modellerine kıyasla nispeten daha büyük boyutları göz önüne alındığında mükemmel bir seçenek sunar¹⁵ (Şekil 2). Hem kardiyopulmoner baypas (CPB) hem de CA'nın etkilerini incelemek için domuz yavrusu modellerinin kullanımı daha önce açıklanmıştır. Bu deneysel hayvan modelleri, hemodinamik değişiklikleri ve ilişkili son doku organ komplikasyonlarını incelemek için yararlıdır 14,16,17,18,19,20. Bu modeller, araştırmacıların çeşitli deneysel koşullar için esneklikle kontrollü bir ortamda insan koşullarını incelemelerine izin vermek için geliştirilmiştir. Çoğu çalışma, ileri cerrahi beceriler gerektiren, daha yüksek kaynak kullanımı gerektiren ve uzun süreli sağkalımı sağlamayı zorlaştıran bir teknik olan merkezi kanülasyonun kullanımını bildirmektedir. Önceki çalışmalar, CPB ^12,15'in incelenmesinde domuz yavrularının kullanımını belgelemiş olsa da, çok azı periferik kanülasyon tekniğini önermiştir.

Bu yeni periferik kanülasyon tekniği, yayınlanmış diğer çalışmalarla karşılaştırıldığında daha kolay, daha az agresif ve daha uygulanabilirdir¹⁹. Ayrıca, bu tekniğin yenidoğanlarda ve küçük hayvanlarda doğrulanması yenidir ve KKH ve ilişkili komorbiditelerini incelemek için bir hayvan modeli kullanmakla ilgilenen tüm araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere düşünülmelidir. Hayvan modeli deneyleri yürütme konusunda deneyimli malzeme, kaynak ve personel ile donatılmış bir laboratuvara erişimi olan kişiler için özellikle uygundur.

Özetle, bu çalışmanın temel amacı, CA ile CPB'nin bir neonatal domuz yavrusu modelini tanımlamak ve doğrulamaktır. Protokol, CPB cerrahisinin ciddi beyin hasarını ve diğer olası komplikasyonlarını, değişen deneysel koşullarla kontrollü bir ortamda incelemeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, çok çeşitli deneysel protokoller için kullanılabilecek genelleştirilebilir, güvenilir ve yüksek kaliteli bir model sağlar.

Protokol

Bu prosedür, Katalonya Karşılaştırmalı Tıp ve Biyogörüntü Merkezi'nin (CEEA-CMCiB) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (CEEA) tarafından onaylanmıştır. Katalonya Hükümeti ayrıca deneysel protokolü (no. 11652), dosya kimlik numarası FUE-2022-02381434'ü ve kimlik QBXQ3RY3J'yi de onayladı. Denetim ve yardım sağlayan sertifikalı veteriner hekimler de dahil olmak üzere deneyimli uygulayıcılar tüm deneyleri gerçekleştirdi. Bu çalışma için 4-6 günlük, 2.5-3.5 kg ağırlığında domuz yavruları (Sus scrofa domestica) kullanıldı. İlgili önyargılardan kaçınmak için cinsiyet dağılımını dengelemek için bir girişimde bulunuldu.

1. Sedasyon, entübasyon ve erişim

1. İntramüsküler Ketamin (20 mg / kg), deksmedetomidin (0.02 mg / kg) ve midazolam (0.3 mg / kg) ile sedasyon ve analjezi başlatın. Hayvan derinlemesine sakinleştirildikten sonra (premedikasyonun uygulanmasından 5 dakika sonra), bir burun maskesi (2 L / dak) ile% 100 O₂ ile oksijenlendirin. Daha sonra, IV propofol (0.5 mg / kg) ile anestezi indükleyin (bkz.
2. Domuz yavrusunu sırt yaslanma pozisyonuna getirin. Trakeanın doğrudan görselleştirilmesini kullanarak 2,5 mm manşetli endotrakeal tüp (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak orotrakeal entübasyon gerçekleştirin.
   1. Akciğer tabanlarının doğrudan oskültasyonu yoluyla uygun endotrakeal tüp yerleşimini onaylayın.
3. Mekanik ventilasyonu dakikada 30 nefes solunum hızı, 8-12 mL/kg tidal hacim ve 4 cmH₂O ekspirasyon sonu basıncı sağlayacak şekilde ayarlayın.
4. Protokol sırasında kalp atış hızı (HR), kan basıncı (BP) ve oksijen satürasyonu (spO2) ile anestezi derinliğini sürekli olarak izleyin. Ventilasyon ve sedasyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
   NOT: Hayati değerler için ideal değerler 130-160 bpm'lik bir HR, 75-95/60-70 BP ve 85'> bir spO2'dir.
5. % 1.5 sevofluran ve fentanil (25-200 μg / kg / dak) ile sedasyonu koruyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Kateterleri femoral arter (3 Fr) ve ven (4 Fr) içine yerleştirmek için doğrudan görselleştirmeyi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Bu kateterler ilaç uygulaması ve numune alımı için kullanılacaktır. Bu nedenle, erişimi sürdürmek önemlidir.

2. CPB devresi kurulumu ve hazırlama

1. Aşağıdaki adımları izleyerek CPB devresini özelleştirin ve kurun (Şekil 3):
   1. Boruyu mümkün olduğunca kısaltın, ancak yine de hayvanın makineden ulaşması için yeterli mesafeye izin verin.
   2. Membran oksijenatöründen ( Malzeme Tablosuna bakın) dışarı akışı pompaya girişe bağlayan bir boru köprüsü oluşturun ve takın.
      NOT: Köprü, hayvanın CA'ları gerçekleştirilirken kanın makinede dolaşmaya devam etmesine izin vermek için hayati önem taşır.
2. Tüm bağlantı noktaları kapatıldıktan sonra, devreyi 300 mL heparin-salin solüsyonu (1 L salin içine karıştırılmış 1.000 UI heparin) ve 300 mL taze donör domuz kanı ile doldurun, ardından 3.5 mEq sodyum bikarbonat, 350 UI heparin ve 450 mg kalsiyum glukonat (bkz.
   1. Kan, heparin-salin, sodyum bikarbonat ve kalsiyum glukonat karışımını tüm devre boyunca 2 dakika boyunca 0,3 L/dk hızında çalıştırarak devreyi "süpürün".

3. Cerrahi ve CPB başlangıcı

NOT: Ek Şekil 1 , kanül yerleştirilmesi için gerekli cerrahi malzemeleri göstermektedir.

1. Kanülasyona hazırlanmak için sol iç juguler veni ve sağ karotid arteri açığa çıkarın (Şekil 4).
2. Kanülasyon için Seldinger veya "tel üstü" tekniği^{kullanın 21}.
   1. İlk olarak, sol iç juguler ven içine bir iğne kateteri yerleştirin. Bir kan parlaması görüntülendiğinde, kaba dikkatlice bir kılavuz tel yerleştirin ve telin yerinde kalmasını sağlayarak iğneyi çıkarın.
   2. Telin üzerine ve kabın içine bir dilatör geçirin, ardından dilatörü çıkarın.
   3. Tel hala yerindeyken, 8 Fr venöz kanülü geçirin ve yavaşça kabın içine ~ 4 cm ilerletin. Kanülün yerinde kaldığından emin olarak teli dikkatlice çıkarın.
   4. Sağ karotis artere 6 Fr pediatrik arteriyel kanül yerleştirmek için Seldinger tel tekniğini dilatasyon ile tekrarlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Arteriyel kanülasyon sırasında, yeni yerleştirilen arteriyel kanül yoluyla bir bolus intravenöz heparin (50 IU / kg) uygulayın.
3. Erişim sağlandıktan sonra, yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için her iki kanülü de 3-0 poli emilebilir sütürler ve bant kullanarak hayvana güvenli bir şekilde sabitleyin (Şekil 5).
4. Kanülleri CPB devresine bağlayın ve devrede hava oluşmasını önlemek için bağlantı noktalarına heparinli tuzlu su eklendiğinden emin olun.
5. İlk akışı 80-85 mL/kg/dk'ya ayarlayın ve yavaşça 150 mL/kg/dk'lık nihai akış hızına yükseltin.
   NOT: Hayvan, deneylerin gerektirdiği sürece CPB'de kalabilir. 1-3 adımlarının bir şeması Ek Şekil 2'de gösterilmiştir.

4. Dolaşım ve kalp durması (CA)

1. CA'yı indüklemek için 9 mEq KCl uygulayın. Tam arresti değerlendirmek için hayati değerleri kullanın ve ekokardiyografi ile onaylayın. Gerektiğinde ek KCl uygulayın.
2. Kalp durduktan sonra, dolaşım durmasını sağlamak için hayvanı devreden izole edin.
3. 1.500 rpm'de dolaşan daha önce açıklanan köprüyü (adım 3.5) kullanarak CPB devre akışını koruyun.

5. Ekstrakorporeal kardiyopulmoner resüsitasyon (eCPR)

1. Uygun CA koşulu (0 dakika, 30 dakika veya 60 dakika) elde edildiğinde, eCPR resüsitasyonuna başlayın.
2. Domuz yavrusunu CPB devresine yeniden bağlayın.
3. Periferik arteriyel erişim yoluyla 3 mL kalsiyum glukonat (2.25 mmol / 10 mL, 1: 2 seyreltilmiş) ve 6 mL sodyum bikarbonat (1 M, 1: 2 seyreltilmiş) uygulayın ve gerektiği kadar doz ekleyin.
   NOT: Gerekirse kardiyoversiyon veya inotropik ilaçlar (adrenalin veya dopamin) kullanılabilir.

6. Ameliyat sonrası bakım

1. Resüsitasyon yapıldıktan sonra, stabiliteyi sağlamak için hayati değerleri 15 dakika izleyin.
   NOT: Yoğun bakım ünitesi döneminde ideal parametreler şunlardır: HR 100-150 bpm, BP 75-95/60-70 ve spO2 > 85.
2. Hayvanları manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için transfer edin.
   NOT: Görüntülemeden sonra, hayvanlar asla iyileşmedi ve histolojik analiz için beyin örnekleri elde etmek için intravenöz pentobarbital sodyum uygulaması yoluyla anestezi altındayken ötenazi yapıldı. Numune toplama stratejisi de dahil olmak üzere prosedürün deneysel kısmının bir zaman çizelgesi Ek Şekil 3'te görüntülenebilir.

Sonuçlar

6 aylık bir süre boyunca, tam protokol, pediatrik yoğun bakım doktorları, pediatrik kardiyologlar, veterinerler ve teknisyenlerden oluşan disiplinler arası bir ekip tarafından 12 kez gerçekleştirildi (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3).

Şekil 1 ve Şekil 2 , bu protokolde kullanılan hayvanların beklenen anatomisini göstermektedir. Dahil edilen domuz yavruları ortalama 4.8 günlüktü (4-6 gün...

Tartışmalar

Kardiyopulmoner baypas, yetişkinler, çocuklar ve yenidoğanlar için kalp cerrahisi sırasında yaygın olarak kullanılır. Kanı oksijenlendirmek ve pulmoner ve kardiyak stabilizasyon sağlamak için birlikte çalışan motorlu bir ekstrakorporeal devre ve membran oksijenatörüne dayanır. Önceki çalışmalar, KPB'nin hem hasta hem de eski sağlıklı hastalarda birçok organ sistemini (böbrek, serebral, pulmoner, kardiyak, gastrointestinal) olumsuz etkileyebileceğini göstermiştir 22,23,24.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted