Pädiatrisches Tiermodell der extrakorporalen kardiopulmonalen Wiederbelebung nach längerem Kreislaufstillstand

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein neonatales Schweinemodell des kardiopulmonalen Bypasses (CPB) mit Kreislauf- und Herzstillstand als Instrument zur Untersuchung schwerer Hirnschäden und anderer Komplikationen infolge von CPB.

Zusammenfassung

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigste angeborene Fehlbildung, von der weltweit etwa eine Million Geburten pro Jahr betroffen sind. Eine umfassende Erforschung dieser Krankheit erfordert geeignete und validierte Tiermodelle. Ferkel werden aufgrund ihrer analogen Anatomie und Physiologie häufig für die translationale Forschung verwendet. Ziel dieser Arbeit war es, ein neonatales Ferkelmodell des kardiopulmonalen Bypasses (CPB) mit Kreislauf- und Herzstillstand (CA) als Werkzeug zur Untersuchung schwerer Hirnschäden und anderer Komplikationen bei Herzoperationen zu beschreiben und zu validieren. Neben einer Liste von Materialien bietet diese Arbeit einen Fahrplan für andere Ermittler zur Planung und Durchführung dieses Protokolls. Nachdem erfahrene Praktiker mehrere Versuche durchgeführt hatten, zeigten die repräsentativen Ergebnisse des Modells eine Erfolgsquote von 92%, wobei die Misserfolge auf die Größe der kleinen Ferkel und die unterschiedliche Gefäßanatomie zurückzuführen waren. Darüber hinaus ermöglichte das Modell den Praktikern, aus einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu wählen, darunter unterschiedliche Zeiten in CA, Temperaturänderungen und pharmakologische Interventionen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei dieser Methode Materialien verwendet werden, die in den meisten Krankenhäusern leicht verfügbar sind, zuverlässig und reproduzierbar sind und in großem Umfang eingesetzt werden können, um die translationale Forschung bei Kindern, die sich einer Herzoperation unterziehen, zu verbessern.

Einleitung

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigste angeborene Fehlbildung, von der weltweit etwa eine Million Geburten pro Jahr betroffen sind¹. Obwohl moderne Fortschritte in der Herz-Thorax-Chirurgie (CTS) und der intensivmedizinischen Behandlung die Sterblichkeitsraten verbessert haben, sind Komorbiditäten nach wie vor extrem häufig 2,3,4,5. Neurologische Entwicklungsstörungen, einschließlich kognitiver und motorischer Beeinträchtigungen sowie Lernbehinderungen, werden bei etwa 25%-50% dieser Patienten berichtet ^6,7,8. Es hat sich gezeigt, dass Operationen in den ersten Lebenstagen, insbesondere solche, die einen Kreislauf- und Herzstillstand (CA) erfordern, die Morbidität erhöhen⁹. Hämodynamische Veränderungen während der Operation können einen wichtigen Einfluss auf das verletzliche sich entwickelnde Gehirn des Neugeborenen haben. Experimentelle Modelle sind unerlässlich, um die Ursache dieser Anomalien besser zu verstehen und neuroprotektive Strategien zu untersuchen, um die Prognosen dieser Patienten zu verbessern.

Die Verwendung von Tiermodellen zur Untersuchung dieser Population ist umfassend dokumentiert 5,10,11,12,13,14. Insbesondere Ferkel bieten eine ausgezeichnete Option, da sie sich in Bezug auf die Herzanatomie (Abbildung 1), das Genom und die Physiologie annähern und im Vergleich zu anderen Tiermodellen relativ größer sind¹⁵ (Abbildung 2). Die Verwendung von Ferkelmodellen zur Untersuchung der Auswirkungen sowohl des kardiopulmonalen Bypasses (CPB) als auch der CA wurde bereits beschrieben. Diese experimentellen Tiermodelle sind nützlich für die Untersuchung hämodynamischer Veränderungen und der damit verbundenen Komplikationen der Endgewebeorgane 14,16,17,18,19,20. Diese Modelle wurden entwickelt, um es Forschern zu ermöglichen, menschliche Bedingungen in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen, mit Flexibilität für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen. Die meisten Studien berichten über den Einsatz der zentralen Kanülierung, einer Technik, die fortgeschrittene chirurgische Fähigkeiten erfordert, einen höheren Ressourcenverbrauch erfordert und es schwierig macht, ein langfristiges Überleben zu gewährleisten. Obwohl frühere Studien den Einsatz von Ferkeln bei der Untersuchung von CPB^{dokumentiert haben 12,15}, haben nur wenige die Technik der peripheren Kanülierung vorgeschlagen.

Diese neue periphere Kanülentechnik ist im Vergleich zu anderen veröffentlichten Studien einfacher, weniger aggressiv und praktikabler¹⁹. Darüber hinaus ist die Validierung dieser Technik bei Neugeborenen und Kleintieren neu und sollte für alle Forscher in Betracht gezogen werden, die daran interessiert sind, ein Tiermodell zur Untersuchung von KHK und den damit verbundenen Komorbiditäten zu verwenden. Es eignet sich besonders für Personen, die Zugang zu einem Labor haben, das mit Verbrauchsmaterialien, Ressourcen und Personal ausgestattet ist und Erfahrung in der Durchführung von Tiermodellversuchen hat.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Hauptziel dieser Studie darin besteht, ein neonatales Ferkelmodell von CPB mit CA zu beschreiben und zu validieren. Das Protokoll zielt darauf ab, schwere Hirnschäden und andere mögliche Komplikationen der CPB-Operation in einer kontrollierten Umgebung mit unterschiedlichen experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Diese Methode liefert ein Modell, das verallgemeinerbar, zuverlässig und von hoher Qualität ist und für eine Vielzahl von experimentellen Protokollen verwendet werden kann.

Protokoll

Das vorliegende Verfahren wurde von der Ethikkommission für Tierversuche (CEEA) des Zentrums für vergleichende Medizin und Bioimage in Katalonien (CEEA-CMCiB) genehmigt. Die Regierung von Katalonien genehmigte auch das Versuchsprotokoll (Nr. 11652), die Aktennummer FUE-2022-02381434 und die ID QBXQ3RY3J. Erfahrene Praktiker, einschließlich zertifizierter Tierärzte, die Aufsicht und Unterstützung boten, führten alle Experimente durch. Für die vorliegende Studie wurden Ferkel (Sus scrofa domestica) im Alter von 4-6 Tagen mit einem Gewicht von 2,5-3,5 kg verwendet. Es wurde versucht, die Geschlechterverteilung auszugleichen, um damit verbundene Verzerrungen zu vermeiden.

1. Sedierung, Intubation und Zugang

1. Sedierung und Analgesie mit intramuskulärem Ketamin (20 mg/kg), Dexmedetomidin (0,02 mg/kg) und Midazolam (0,3 mg/kg) einleiten. Sobald das Tier tief sediert ist (5 Minuten nach Verabreichung der Prämedikation), sauerstoffhaltig mit 100% O₂ über eine Schnauzenmaske (2 L/min). Als nächstes wird eine Anästhesie mit i.v. Propofol (0,5 mg/kg) eingeleitet (siehe Materialtabelle).
2. Positionieren Sie das Ferkel in der dorsalen Liegeposition. Die orotracheale Intubation wird mit einem 2,5 mm Endotrachealtubus mit Manschette (siehe Materialtabelle) unter direkter Visualisierung der Luftröhre durchgeführt.
   1. Bestätigen Sie die geeignete Platzierung des Endotrachealtubus durch direkte Auskultation der Lungenbasen.
3. Stellen Sie die mechanische Beatmung so ein, dass sie eine Atemfrequenz von 30 Atemzügen pro Minute, ein Atemzugvolumen von 8-12 ml/kg und einen endexspiratorischen Druck von 4 cmH₂O liefert.
4. Überwachen Sie kontinuierlich die Tiefe der Anästhesie während des Protokolls über Herzfrequenz (HF), Blutdruck (BP) und Sauerstoffsättigung (spO2). Passen Sie die Beatmungs- und Sedierungsparameter nach Bedarf an.
   HINWEIS: Die idealen Werte für die Vitalwerte sind eine HR von 130-160 bpm, ein BP von 75-95/60-70 und ein spO2 > 85.
5. Aufrechterhaltung der Sedierung mit 1,5 % Sevofluran und Fentanyl (25-200 μg/kg/min) (siehe Materialtabelle).
6. Verwenden Sie die direkte Visualisierung, um Katheter in der Oberschenkelarterie (3 Fr) und der Vene (4 Fr) zu platzieren (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Diese Katheter werden für die Verabreichung von Medikamenten und die Probenentnahme verwendet. Daher ist es wichtig, den Zugang aufrechtzuerhalten.

2. Aufbau und Grundierung der CPB-Schaltung

1. Passen Sie die CPB-Schaltung an und richten Sie sie ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen (Abbildung 3):
   1. Kürzen Sie den Schlauch so weit wie möglich, während Sie immer noch genügend Abstand haben, um das Tier von der Maschine zu erreichen.
   2. Erstellen und befestigen Sie eine Schlauchbrücke, die den Abfluss aus dem Membranoxygenator (siehe Materialtabelle) mit dem Zufluss in die Pumpe verbindet.
      HINWEIS: Die Brücke ist wichtig, damit das Blut weiterhin durch das Gerät zirkulieren kann, während die CAs des Tieres durchgeführt werden.
2. Sobald alle Verbindungspunkte verschlossen sind, grundieren Sie den Kreislauf mit 300 ml einer Heparin-Kochsalzlösung (1.000 IE Heparin gemischt in 1 l Kochsalzlösung) und 300 mL frischem Spenderschweineblut, gefolgt von 3,5 mEq Natriumbicarbonat, 350 IE Heparin und 450 mg Calciumgluconat (siehe Materialtabelle).
   1. "Sweepen" Sie den Kreislauf, indem Sie das Blut-, Heparin-Kochsalz-, Natriumbicarbonat- und Calciumgluconat-Gemisch 2 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 0,3 l/min durch den gesamten Kreislauf laufen lassen.

3. Operation und CPB-Beginn

HINWEIS: Die ergänzende Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Materialien, die für die Platzierung der Kanüle erforderlich sind.

1. Legen Sie die linke Vena jugularis interna und die rechte Halsschlagader frei, um die Kanülierung vorzubereiten (Abbildung 4).
2. Für die Kanülierung verwenden Sie die Seldinger- oder "Over-the-Wire"-Technik²¹.
   1. Führen Sie zunächst einen Nadelkatheter in die linke Vena jugularis interna ein. Sobald ein Blutblitz sichtbar wird, führen Sie vorsichtig einen Führungsdraht in das Gefäß ein und entfernen Sie die Nadel, um sicherzustellen, dass der Draht an Ort und Stelle bleibt.
   2. Fädeln Sie einen Dilatator über den Draht und in das Gefäß und entfernen Sie dann den Dilatator.
   3. Wenn der Draht noch an Ort und Stelle ist, fädeln Sie eine 8 Fr Venenkanüle ein und schieben Sie sie langsam ~4 cm in das Gefäß vor. Entfernen Sie vorsichtig den Draht und stellen Sie sicher, dass die Kanüle an Ort und Stelle bleibt.
   4. Wiederholen Sie die Seldinger-Drahttechnik mit Dilatation, um eine pädiatrische arterielle Kanüle mit 6 Fr (siehe Materialtabelle) in die rechte Halsschlagader zu platzieren.
   5. Zum Zeitpunkt der arteriellen Kanülierung ist ein Bolus mit intravenösem Heparin (50 I.E./kg) über die neu platzierte arterielle Kanüle zu verabreichen.
3. Sobald der Zugang erreicht ist, befestigen Sie beide Kanülen mit 3-0 polyresorbierbaren Nähten und Klebeband sicher am Tier, um ein versehentliches Entfernen zu verhindern (Abbildung 5).
4. Schließen Sie die Kanülen an den CPB-Kreislauf an und stellen Sie sicher, dass Kochsalzlösung mit Heparin an den Verbindungspunkten hinzugefügt wird, um Luft im Kreislauf zu verhindern.
5. Stellen Sie den anfänglichen Durchfluss auf 80-85 ml/kg/min ein und erhöhen Sie ihn langsam auf eine endgültige Durchflussrate von 150 mL/kg/min.
   HINWEIS: Das Tier kann so lange auf dem CPB bleiben, wie es die Versuche erfordern. Ein Schema der Schritte 1 bis 3 ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

4. Kreislauf- und Herzstillstand (CA)

1. Um CA zu induzieren, verabreichen Sie 9 mEq KCl. Verwenden Sie die Vitalwerte, um den vollständigen Stillstand zu beurteilen und mit Echokardiographie zu bestätigen. Verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche KCl.
2. Sobald das Herz zum Stillstand gekommen ist, isolieren Sie das Tier aus dem Kreislauf, um einen Kreislaufstillstand auszulösen.
3. Aufrechterhaltung des Durchflusses des CPB-Kreislaufs mit der zuvor beschriebenen Brücke (Schritt 3.5), die mit 1.500 U/min zirkuliert.

5. Extrakorporale Herz-Lungen-Wiederbelebung (eCPR)

1. Sobald die entsprechende CA-Bedingung (0 min, 30 min oder 60 min) erreicht ist, beginnen Sie mit der eCPR-Wiederbelebung.
2. Schließen Sie das Ferkel wieder an den CPB-Kreislauf an.
3. Verabreichen Sie 3 ml Calciumgluconat (2,25 mmol/10 ml, 1:2 verdünnt) und 6 ml Natriumbicarbonat (1 M, 1:2 verdünnt) über den peripheren arteriellen Zugang und fügen Sie bei Bedarf Dosen hinzu.
   HINWEIS: Bei Bedarf können Kardioversion oder inotrope Medikamente (Adrenalin oder Dopamin) verwendet werden.

6. Nachsorge

1. Überwachen Sie nach der Wiederbelebung die Vitalwerte 15 Minuten lang, um die Stabilität zu gewährleisten.
   HINWEIS: Ideale Parameter auf der Intensivstation sind: HR von 100-150 bpm, BP von 75-95/60-70 und spO2 > 85.
2. Übertragen Sie die Tiere zur Magnetresonanztomographie (MRT).
   HINWEIS: Nach der Bildgebung erholten sich die Tiere nicht mehr und wurden unter Narkose durch intravenöse Verabreichung von Pentobarbital-Natrium eingeschläfert, um Gehirnproben für die histologische Analyse zu erhalten. Eine Zeitleiste des experimentellen Teils des Verfahrens, einschließlich der Strategie zur Probenentnahme, ist in der ergänzenden Abbildung 3 zu sehen.

Ergebnisse

Während eines Zeitraums von 6 Monaten wurde das gesamte Protokoll 12 Mal von einem interdisziplinären Team aus pädiatrischen Intensivmedizinern, Kinderkardiologen, Tierärzten und Technikern durchgeführt (Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3).

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die erwartete Anatomie der Tiere, die in diesem Protokoll verwendet werden. Die eingeschlossenen Ferkel wa...

Diskussion

Der kardiopulmonale Bypass wird häufig bei Herzoperationen bei Erwachsenen, Kindern und Neugeborenen eingesetzt. Es beruht auf einem motorisierten extrakorporalen Schaltkreis und einem Membranoxygenator, die zusammenarbeiten, um das Blut mit Sauerstoff zu versorgen und die Lungen- und Herzstabilisierung zu gewährleisten. Frühere Studien haben gezeigt, dass CPB viele Organsysteme (Nieren-, Hirn-, Lungen-, Herz-, Magen-Darm-System) sowohl bei kranken als auch bei ehemals gesunden Patienten beeinträchtigen kann 22,23,24...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted