大豆毛根转化基因功能分析

摘要

在这里，我们提出了一种高效生产转基因大豆毛根的方案。

摘要

大豆（Glycine max）是一种有价值的农业作物，具有数千种工业用途。大豆根系是与土壤传播微生物相互作用的主要场所，这些微生物形成共生以固定氮和病原体，这使得涉及大豆根遗传学的研究对于提高其农业生产至关重要。大豆毛根（HRs）的遗传转化由根 茎农杆菌 菌株NCPPB2659（K599）介导，是研究大豆根系基因功能的有效工具，从开始到结束仅需2个月。在这里，我们提供了一个详细的协议，概述了在大豆HR中过表达和沉默目的基因的方法。该方法包括大豆种子灭菌，用K599感染子叶，以及选择和收获基因转化的HR进行RNA分离，并在必要时进行代谢物分析。该方法的通量足以同时研究多个基因或网络，并且可以在致力于长期稳定的转化方法之前确定最佳工程策略。

引言

大豆（Glycine max）是农业中最有价值的作物之一。它具有数以千计的商业和工业用途，例如食品，动物饲料，油，并作为制造原料的来源¹。它与固氮土壤微生物（即根瘤菌）形成共生关系的能力进一步提升了研究大豆遗传学的重要性²。例如，微调大豆根系的固氮特性可以减少碳排放，并大大降低对氮肥的需求³。因此，特别是了解控制大豆根生物学方面的遗传学在农业和工业中具有广泛的应用。考虑到这些好处，有一个可靠的方案来分析大豆基因的功能是很重要的。

根癌农杆菌可能是植物遗传转化最常用的工具，因为它具有将转移DNA（T-DNA）整合到许多植物物种的核基因组中的能力。当农杆菌感染植物时，它将肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主染色体中，导致在感染部位形成肿瘤。几十年来，农杆菌介导的转化已被广泛用于基因功能分析和修改作物性状^4。尽管任何目的基因都可以通过根癌曲霉介导的转化轻松转移到宿主植物细胞中，但这种方法有几个缺点;它耗时、昂贵，并且需要对大豆等许多植物物种提供广泛的专业知识。虽然少数品种的大豆可以通过使用根癌农杆菌的子叶节点方法进行转化，但这种方法的低效率需要一种快速高效的替代遗传转化技术

研究方案

注意：建议所有后续步骤在无菌条件下进行。

1.大豆种子杀菌

1. 在生物安全柜中，将 16-20 圆形威廉姆斯 82 大豆种子置于原始状态（即无裂缝或瑕疵）中 50 mL 离心管中。
2. 加入 30 mL 的 70% 异丙醇，轻轻摇晃 30 秒，然后倒出酒精。
3. 用30mL的10%漂白剂轻轻摇动种子10秒，并使种子在室温（室温，25°C）下在溶液中静置5分钟。5分钟后，沥干漂白剂。
4. 用30mL无菌超纯H 2 O重复摇动三次，每次冲洗1分钟，并在每次冲洗之间丢弃H₂O。
5. 将灭菌的种子放在饱和有 5 mL 发芽和共培养 （GC） 培养基（高压灭菌器半强度液体 Murashige 和 Skoog [MS] 培养基，含 1% 蔗糖 [pH = 5.8] 的滤纸上，然后加入 2.5 mL/L 维生素）在无菌培养皿中。
6. 将板在室温（25°C）下在黑暗中放置3天，然后在22°C下在16小时冷白T5荧光灯（100μE ^m-2·s-1）下转移板4天以使种子发芽。
   注意：丢弃起皱或破裂的种子。最好的种子是那些大而均匀黄色的种子。消毒至少两倍于实验所需的种子数量，以选择高质量的种子，因为某些种子可能由于损坏、疾病或发芽失败而不是最佳的。

讨论

在过去的十年中，大豆HR方法已被开发为研究参与固氮^22,23，生物和非生物胁迫耐受性24,25以及代谢物生物合成途径^26,27的基因的有力工具。植物如何产生代谢物的知识对农业生产和制药工业有很多好处，因为它可用于研究参与介导对病原体的生化防御的基因网络

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010