Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la production à haute efficacité de racines velues de soja transgéniques.

Résumé

Le soja (Glycine max) est une culture précieuse en agriculture qui a des milliers d’utilisations industrielles. Les racines de soja sont le principal site d’interaction avec les microbes du sol qui forment une symbiose pour fixer l’azote et les agents pathogènes, ce qui rend la recherche sur la génétique des racines de soja d’une importance primordiale pour améliorer sa production agricole. La transformation génétique des racines velues du soja (HR) est médiée par la souche Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) et constitue un outil efficace pour étudier la fonction des gènes dans les racines de soja, ne prenant que 2 mois du début à la fin. Ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit la méthode pour surexprimer et réduire au silence un gène d’intérêt dans les HRs de soja. Cette méthodologie comprend la stérilisation des graines de soja, l’infection des cotylédons par K599, ainsi que la sélection et la récolte de RR génétiquement transformés pour l’isolement de l’ARN et, s’il y a lieu, l’analyse des métabolites. Le débit de l’approche est suffisant pour étudier simultanément plusieurs gènes ou réseaux et pourrait déterminer les stratégies d’ingénierie optimales avant de s’engager dans des approches de transformation stables à long terme.

Introduction

Le soja (Glycine max) est l’une des cultures les plus précieuses en agriculture. Il a des milliers d’utilisations commerciales et industrielles, telles que l’alimentation, l’alimentation animale, l’huile et comme source de matières premières pour la fabrication¹. Sa capacité à former une relation symbiotique avec les microorganismes fixateurs d’azote du sol, à savoir les rhizobiums, accroît encore l’importance de l’étude de la génétique du soja². Par exemple, le réglage fin des propriétés de fixation de l’azote dans les racines de soja peut entraîner une réduction des émissions de carbone et réduire considérablement les besoins en engrais azoté³. Ainsi, la compréhension de la génétique qui contrôle certains aspects de la biologie des racines du soja, en particulier, a de nombreuses applications dans l’agriculture et l’industrie. Compte tenu de ces avantages, il est important de disposer d’un protocole fiable pour analyser la fonction des gènes du soja.

Agrobacterium tumefaciens est peut-être l’outil le plus couramment utilisé pour la transformation phytogénétique, car il a la capacité d’intégrer l’ADN de transfert (ADN-T) dans le génome nucléaire de nombreuses espèces végétales. Lorsque Agrobacterium infecte une plante, il transfère le plasmide induisant la tumeur (Ti) dans le chromosome hôte, conduisant à la formation d’une tumeur sur le site d’infection. La transformation médiée par Agrobacterium est largement utilisée depuis des décennies pour l’analyse fonctionnelle des gènes et pour modifier les caractères des cultures⁴. Bien que tout gène d’intérêt puisse être facilement transféré dans les cellules végétales hôtes par transformation médiée par A. tumefaciens, cette méthode présente plusieurs inconvénients; Il prend du temps, coûte cher et nécessite une expertise approfondie pour de nombreuses espèces végétales, telles que le soja. Bien que quelques variétés de soja puissent être transformées par l’approche des ganglions cotylédonaires à l’aide d’A. tumefaciens, l’inefficacité de cette approche nécessite une autre technologie de transformation génétique rapide et très efficace ^4,5. Même un non-expert peut utiliser cette méthode de transformation de racine velue médiée par Agrobacterium rhizogenes pour surmonter ces inconvénients.

La transformation HR est un outil relativement rapide, non seulement pour analyser la fonction des gènes, mais aussi pour des applications biotechnologiques, telles que la production de métabolites spécialisés et de produits chimiques fins, et de glycoprotéines bioactives complexes⁶. La production de HRs de soja ne nécessite pas une expertise approfondie, car ils peuvent être générés en blessant la surface des cotylédons, suivi d’une inoculation avec Agrobacterium rhizogenes⁷. A. rhizogenes exprime des gènes de virulence (Vir) codés par son plasmide Ti qui transfèrent, transportent et intègrent son segment d’ADN-T dans le génome des cellules végétales tout en stimulant simultanément la croissance des racines ectopiques⁸.

Comparé à d’autres systèmes d’expression génique du soja, tels que la biolistique ou la transformation à base d’A. tumefaciens de la culture tissulaire, cellulaire et organique, le système d’expression HR présente plusieurs avantages. Premièrement, les HR sont génétiquement stables et produites rapidement sur des milieux sans hormones ^1,9,10. De plus, les HRs peuvent produire des métabolites spécialisés en quantités équivalentes ou supérieures à celles des racines indigènes^11,12. Ces avantages font des HRs un outil biotechnologique souhaitable pour les espèces végétales qui sont incompatibles avec A. tumefaciens ou qui nécessitent des conditions spéciales de culture tissulaire pour former des tissus compatibles. La méthode HR est une approche efficace pour analyser les interactions protéine-protéine, la localisation subcellulaire des protéines, la production de protéines recombinantes, la phytoremédiation, la mutagénèse et les effets à l’échelle du génome en utilisant le séquençage de l’ARN^13,14,15. Il peut également être utilisé pour étudier la production de métabolites spécialisés qui ont une valeur dans l’industrie, y compris les glycéollines, qui médicamentent la défense du soja contre l’important agent pathogène microbien Phytophthora sojae et ont des activités anticancéreuses et neuroprotectrices impressionnantes chez l’homme^16,17.

Ce rapport démontre un protocole simple et efficace pour produire des HRs de soja. Par rapport aux méthodes précédentes de transformation HR, ce protocole fournit une amélioration significative (33%-50%) du taux de formation HR en présélectionnant les transformateurs A. rhizogenes pour la présence du plasmide Ti avant l’inoculation des cotylédons de soja. Nous démontrons l’applicabilité de ce protocole en transformant plusieurs vecteurs binaires qui surexpriment ou réduisent au silence les gènes du facteur de transcription du soja.

Protocole

REMARQUE : Il est recommandé que toutes les étapes de la procédure soient effectuées dans des conditions stériles.

1. Stérilisation des semences de soja

1. Dans une enceinte de biosécurité, placer 16 à 20 graines de soja Williams 82 rondes en parfait état (c.-à-d. sans fissures ni imperfections) dans un tube à centrifuger de 50 mL.
2. Ajouter 30 mL d’alcool isopropylique à 70 %, agiter doucement pendant 30 s, puis décanter l’alcool.
3. Agiter doucement les graines avec 30 ml d’eau de Javel à 10 % pendant 10 s et laisser reposer les graines dans la solution pendant 5 minutes à température ambiante (RT, 25 °C). Après 5 min, égoutter l’eau de Javel.
4. Répéter l’agitation trois fois avec 30 mL de_H2Oultrapur stérile pendant 1 min par rinçage et jeter le H_2Oentre chaque rinçage.
5. Placer les graines stérilisées sur du papier filtre saturé de 5 mL de milieu de germination et de coculture (GC) (liquide autoclave demi-concentré Murashige et milieu Skoog [MS] avec 1 % de saccharose [pH = 5,8], puis ajouter 2,5 mL/L de vitamines) dans des boîtes de Petri stériles.
6. Placer les plaques dans l’obscurité à TA (25 °C) pendant 3 jours avant de transférer les plaques à 22 °C sous 16 h de lampes fluorescentes T5 blanc froid (100 μE ^m-2·s-1) pendant 4 jours pour permettre aux graines de germer.
   REMARQUE: Jetez les graines qui sont ridées ou craquelées. Les meilleures graines sont celles qui sont grandes et uniformément jaunes. Stérilisez au moins le double du nombre de graines nécessaires à l’expérience pour sélectionner des graines de bonne qualité, car certaines graines peuvent ne pas être optimales en raison de dommages, de maladies ou d’une absence de germination.

2. Infection des cotylédons par K599

REMARQUE: Utilisez des vecteurs de la série pGWB, car leur double sélection assure l’intégration génomique de l’ensemble de la cassette d’ADN-T. L’électroporation a été utilisée pour transformer un vecteur binaire hébergeant le gène d’intérêt en A. rhizogenes pRi2659¹⁸.

1. Sur la base de la séquence du plasmide¹⁸ de A. rhizogenes pRi2659, concevoir des amorces pour détecter le gène du plasmide Ti VirD2 (VirD2 avant: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 inverse: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Taille d’amplification prévue : 221 pb). Après transformation, tester les colonies d’Agrobacterium pour la rétention de VirD2 par amplification en chaîne de la polymérase (PCR) à l’aide d’un kit de PCR (voir le tableau des matériaux). Cycle PCR : 94 °C pendant 3 min ; 35 cycles (94 °C pendant 1 min, 58 °C pendant 30 sec, 72 °C pendant 1 min); et 72 °C pendant 10 min.
2. Après la sélection de la colonie d’A. rhizogenes qui contient à la fois VirD2 et le gène d’intérêt (GOI), en étaler sur des plaques moyennes de Luria-Bertani (LB) contenant les antibiotiques appropriés (50 mg/L) pour le plasmide d’intérêt et incuber pendant la nuit à 30 °C. Si vous utilisez la spectinomycine, ajouter une concentration de 100 mg/L.
3. Utiliser un embout de pipette P200 pour gratter une longueur de ~1,5 cm de l’agrobactérie K599 des plaques LB et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon phosphate (PB; 0,01 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
4. Diluer l’Agrobacterium dans du_H2Oultrapur stérilisé (v/v = 1:1) et de l’acétosyringone (AS; 100 mM de stock dans du diméthylsulfoxyde [DMSO], v/v = 1:1000). Mesurer l’absorbance à l’aide d’un tube cuvette à une densité optique de 600 nm (OD600). La plage optimale attendue se situe entre 0,5 et 0,8.
5. Dans une enceinte de biosécurité, tremper un scalpel stérilisé dans la solution K599 Agrobacterium et effectuer plusieurs coupes de 1 mm de profondeur le long de la surface interne (adaxiale, côté plat) du cotylédon. Pendant l’inoculation, utilisez des pinces stérilisées pour stabiliser le cotylédon.
6. Placer environ 6 à 8 cotylédons coupés sur une boîte de Petri contenant du papier filtre saturé de milieu GC avec AS.
   NOTE: Pour préparer 6 plaques, 50 mL de milieu GC et 50 μL de 100 mM AS pour atteindre une concentration finale de 100 μM est suffisant.
7. Incuber les plaques à TA (25 °C) pendant 3 jours sous une photopériode de 16 h (~65 μE).
8. Transférer les cotylédons infectés sur des plaques de croissance racinaire velue (MS demi-concentrée autoclave avec 3 % de saccharose [pH = 5,8] et 2,6 g/L de Gelzan, puis ajouter 2,5 mL/L de mélange de vitamines et 500 mg/L de timentine).
   REMARQUE: Il y a eu quelques problèmes avec timentin de certains fournisseurs alternatifs, dont le K599 n’a pas été éliminé. Il est recommandé d’utiliser des plaques de Pétri plus hautes (100 mm x 25 mm) pour le milieu HRG.
9. Incuber les plaques HRG à 22 °C dans une chambre de croissance avec les paramètres réglés sur 100 μE de lumière sur une photopériode de 16 h jusqu’à ce que les racines primaires avec des racines secondaires de 2-3 cm de longueur soient observées (~3-4 semaines).

3. Sélection et récolte des RH

1. Récoltez les racines primaires (5-7 cm de longueur) qui poussent à partir du cal et contiennent des racines secondaires (2-3 cm de longueur) à l’aide d’un scalpel stérile et de forceps. Transférer dans des plaques HRG de sélection contenant les antibiotiques appropriés. Laissez les HRs pousser pendant 5 jours de plus sur les plaques HRG de sélection.
   REMARQUE : La kanamycine (50 mg/L), l’hygromycine (50 mg/L) ou la phosphinothricine (10 mg/L) sont généralement utilisées pour la sélection. Pour les vecteurs d’expression, pGWB2 est utilisé pour la surexpression, pANDA35HK est utilisé pour le silençage de l’ARNi, pGWB6 est utilisé pour la localisation subcellulaire et pMDC7 est utilisé pour l’expression inductible.
2. Le jour 5, récoltez des HRs transgéniques avec des racines secondaires de 3 à 6 cm de longueur. Si l’on observe des protéines fluorescentes, les racines secondaires ont peu d’autofluorescence. Si vous effectuez des traitements éliminatoires ou chimiques, coupez les racines secondaires en morceaux de 1 cm et placez ~ 100 mg sur gélose HRG en tas. Ensuite, saturer les piles avec 80 μL du traitement approprié et laisser les plaques incuber à TA (25 °C).
3. Après le temps de traitement souhaité, procéder à des extractions d’ARN ou de métabolites.
4. Pour l’ARN, tamponnez rapidement les racines sèches sur une serviette en papier stérilisée et récoltez-les directement dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
5. Scellez immédiatement le haut du tube à l’aide d’un parafilm, faites deux petits trous à l’aide de pinces pointues et immergez les tubes dans de l’azote liquide. Lyophiliser pendant 3 jours, puis conserver les échantillons à -80 °C.
   REMARQUE: Il est essentiel de sélectionner des HRs qui sont blancs. Après 5 jours de croissance sur la plaque sélective, les HR transgéniques resteront blanches, mais les racines non transgéniques bruniront.

Résultats

Les résultats représentatifs proviennent des données publiées ^19,20. Les résultats de la PCR (cPCR) de la colonie K599 Agrobacterium transformée sont présentés à la figure 1. Comme l’indiquent les colonies positives de la figure 1, le gène d’intérêt a été détecté par PCR (figure 1A). Cependant, un tiers à la moitié des colonies étaient négati...

Discussion

Au cours de la dernière décennie, la méthode HR du soja a été développée comme un outil puissant pour étudier les gènes impliqués dans la fixation de l’azote 22,23, la tolérance au stress biotique et abiotique 24,25 et les voies de biosynthèse des métabolites ^26,27. La connaissance de la façon dont les plantes produisent des métab...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010