Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Resumen

La soja (Glycine max) es un cultivo valioso en la agricultura que tiene miles de usos industriales. Las raíces de soja son el sitio principal de interacción con los microbios transmitidos por el suelo que forman simbiosis para fijar nitrógeno y patógenos, lo que hace que la investigación que involucra la genética de la raíz de soja sea de suma importancia para mejorar su producción agrícola. La transformación genética de las raíces peludas de soja (HRs) está mediada por la cepa NCPPB2659 de Agrobacterium rhizogenes (K599) y es una herramienta eficiente para estudiar la función génica en las raíces de soja, tomando solo 2 meses de principio a fin. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe el método para sobreexpresar y silenciar un gen de interés en las HR de soja. Esta metodología incluye la esterilización de semillas de soja, la infección de cotiledones con K599 y la selección y recolección de HR genéticamente transformadas para el aislamiento de ARN y, si se justifica, análisis de metabolitos. El rendimiento del enfoque es suficiente para estudiar simultáneamente varios genes o redes y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estables a largo plazo.

Introducción

La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación¹. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja². Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado

Protocolo

NOTA: Se recomienda que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo en condiciones estériles.

1. Esterilización de semillas de soja

1. En un gabinete de bioseguridad, coloque 16-20 semillas de soja Williams 82 redondas en perfectas condiciones (es decir, sin grietas ni manchas) en un tubo de centrífuga de 50 ml.
2. Agregue 30 ml de alcohol isopropílico al 70%, agite suavemente durante 30 s y luego decanta el alcohol.
3. Agitar suavemente las semillas con 30 ml de lejía al 10% durante 10 s y dejar que las semillas reposen en la solución durante 5 min a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Después de ....

Discusión

Durante la última década, el método HR de soja se ha desarrollado como una poderosa herramienta para estudiar genes involucrados en la fijación de nitrógeno 22,23, tolerancia al estrés biótico y abiótico 24,25 y vías biosintéticas de metabolitos ^26,27. El conocimiento de cómo las plantas producen metabolitos tiene una gran cantidad de b.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010