טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

Abstract

פולי סויה (Glycine max) הוא גידול יקר ערך בחקלאות שיש לו אלפי שימושים תעשייתיים. שורשי פולי סויה הם האתר העיקרי של אינטראקציה עם מיקרובים הנישאים באדמה היוצרים סימביוזה כדי לתקן חנקן ופתוגנים, מה שהופך את המחקר המערב גנטיקה של שורש סויה לבעל חשיבות עליונה לשיפור הייצור החקלאי שלה. השינוי הגנטי של שורשים שעירים מפולי סויה (HRs) מתווך על ידי זן קנה השורש Agrobacterium NCPPB2659 (K599) והוא כלי יעיל לחקר תפקוד גנים בשורשי סויה, לוקח רק חודשיים מתחילתו ועד סופו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את השיטה לביטוי יתר והשתקה של גן בעל עניין ב- HRs סויה. מתודולוגיה זו כוללת עיקור זרעי סויה, זיהום של cotyledons עם K599, ובחירה וקציר של HRs מותמרים גנטית עבור בידוד RNA, ואם יש צורך, ניתוח מטבוליטים. התפוקה של הגישה מספיקה כדי לחקור בו זמנית מספר גנים או רשתות ויכולה לקבוע את האסטרטגיות ההנדסיות האופטימליות לפני התחייבות לגישות טרנספורמציה יציבות ארוכות טווח.

Introduction

פולי סויה (גליצין מקסימלי) הם בין הגידולים היקרים ביותר בחקלאות. יש לו אלפי שימושים מסחריים ותעשייתיים, כגון מזון, מזון לבעלי חיים, נפט, וכמקור לחומרי גלם לייצור¹. יכולתו ליצור מערכת יחסים סימביוטית עם מיקרואורגניזמים מקבעי חנקן בקרקע, כלומר ריזוביה, מעלה עוד יותר את החשיבות של חקר גנטיקה של פולי סויה². לדוגמה, כוונון עדין של תכונות קיבוע חנקן בשורשי סויה יכול להוביל להפחתת פליטות פחמן ולהפחית באופן משמעותי את הדרישות לדשן חנקן³. לפיכך, להבנת הגנטיקה השולטת בהיבטים של ביולוגיית שורש הסויה, בפרט, יש יישומים נרחבים בחקלאות ובתעשייה. בהתחשב ביתרונות אלה, חשוב שיהיה פרוטוקול אמין לניתוח תפקוד....

Protocol

הערה: מומלץ שכל שלבי ההליך יתנהלו בתנאים סטריליים.

1. עיקור זרעי סויה

1. בארון בטיחות ביולוגית, הניחו 16-20 זרעי סויה עגולים במצב בתולי (כלומר, ללא סדקים או פגמים) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
2. מוסיפים 30 מ"ל של 70% אלכוהול איזופרופיל, מנערים בעדינות במשך 30 שניות, ולאחר מכן מרוקנים את האלכוהול.
3. נערו בעדינות את הזרעים עם 30 מ"ל של אקונומיקה 10% למשך 10 שניות ואפשרו לזרעים לשבת בתמיסה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT, 25°C). לאחר 5 דקות, מסננים את האקונומיקה.
4. יש לחזור על הניעור שלוש פעמים עם 30 מ"ל של H 2 O סטרילי טהור במיוחד למשךדקה אחת בכל שטיפה ולהשליך את H₂O בין כל ש....

תוצאות

התוצאות המייצגות הן מתוך הנתונים שפורסמו ^19,20. תוצאות PCR (cPCR) של K599 Agrobacterium שעבר טרנספורמציה מוצגות באיור 1. כפי שמצוין על-ידי המושבות החיוביות באיור 1, הגן המעניין זוהה על-ידי cPCR (איור 1A). אולם שליש עד מחצית מ?.......

Discussion

במהלך העשור האחרון, שיטת HR סויה פותחה ככלי רב עוצמה לחקר גנים המעורבים בקיבוע חנקן 22,23, עמידות לעקה ביוטית וא-ביוטית 24,25, ומסלולים ביוסינתטיים מטבוליטים ^26,27. לידע על האופן שבו צמחים מייצרים מטבו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010