טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

Abstract

פולי סויה (Glycine max) הוא גידול יקר ערך בחקלאות שיש לו אלפי שימושים תעשייתיים. שורשי פולי סויה הם האתר העיקרי של אינטראקציה עם מיקרובים הנישאים באדמה היוצרים סימביוזה כדי לתקן חנקן ופתוגנים, מה שהופך את המחקר המערב גנטיקה של שורש סויה לבעל חשיבות עליונה לשיפור הייצור החקלאי שלה. השינוי הגנטי של שורשים שעירים מפולי סויה (HRs) מתווך על ידי זן קנה השורש Agrobacterium NCPPB2659 (K599) והוא כלי יעיל לחקר תפקוד גנים בשורשי סויה, לוקח רק חודשיים מתחילתו ועד סופו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את השיטה לביטוי יתר והשתקה של גן בעל עניין ב- HRs סויה. מתודולוגיה זו כוללת עיקור זרעי סויה, זיהום של cotyledons עם K599, ובחירה וקציר של HRs מותמרים גנטית עבור בידוד RNA, ואם יש צורך, ניתוח מטבוליטים. התפוקה של הגישה מספיקה כדי לחקור בו זמנית מספר גנים או רשתות ויכולה לקבוע את האסטרטגיות ההנדסיות האופטימליות לפני התחייבות לגישות טרנספורמציה יציבות ארוכות טווח.

Introduction

פולי סויה (גליצין מקסימלי) הם בין הגידולים היקרים ביותר בחקלאות. יש לו אלפי שימושים מסחריים ותעשייתיים, כגון מזון, מזון לבעלי חיים, נפט, וכמקור לחומרי גלם לייצור¹. יכולתו ליצור מערכת יחסים סימביוטית עם מיקרואורגניזמים מקבעי חנקן בקרקע, כלומר ריזוביה, מעלה עוד יותר את החשיבות של חקר גנטיקה של פולי סויה². לדוגמה, כוונון עדין של תכונות קיבוע חנקן בשורשי סויה יכול להוביל להפחתת פליטות פחמן ולהפחית באופן משמעותי את הדרישות לדשן חנקן³. לפיכך, להבנת הגנטיקה השולטת בהיבטים של ביולוגיית שורש הסויה, בפרט, יש יישומים נרחבים בחקלאות ובתעשייה. בהתחשב ביתרונות אלה, חשוב שיהיה פרוטוקול אמין לניתוח תפקודם של גנים פולי סויה.

Agrobacterium tumefaciens הוא אולי הכלי הנפוץ ביותר לשינוי גנטי של צמחים, שכן יש לו את היכולת לשלב TRANSFER DNA (T-DNA) לתוך הגנום הגרעיני של מיני צמחים רבים. כאשר אגרובקטריום מדביק צמח, הוא מעביר את הפלסמיד מעורר הגידול (Ti) לכרומוזום המארח, מה שמוביל להיווצרות גידול באתר הזיהום. הטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום נמצאת בשימוש נרחב מזה עשרות שנים לניתוח תפקודי גנים ועל מנת לשנות תכונות יבול⁴. למרות שכל גן מעניין יכול להיות מועבר בקלות לתאי צמח מארח באמצעות טרנספורמציה בתיווך A. tumefaciens, לשיטה זו יש מספר חסרונות; זה גוזל זמן, יקר, ודורש מומחיות נרחבת עבור מיני צמחים רבים, כגון סויה. למרות שכמה זנים של פולי סויה יכולים להשתנות על ידי גישת צומת cotyledonary באמצעות A. tumefaciens, חוסר היעילות של גישה זו מחייב את הצורך בטכנולוגיית טרנספורמציה גנטית חלופית שהיא מהירה ויעילה מאוד ^4,5. אפילו מי שאינו מומחה יכול להשתמש בשיטת טרנספורמציה זו של שורש שעיר בתיווך אגרובקטריום (HR) כדי להתגבר על חסרונות אלה.

טרנספורמציה של HR היא כלי מהיר יחסית, לא רק לניתוח תפקוד גנים, אלא גם ליישומים ביוטכנולוגיים, כגון ייצור מטבוליטים מיוחדים וכימיקלים עדינים, וגליקופרוטאינים ביו-אקטיביים מורכבים⁶. הייצור של HRs סויה אינו דורש מומחיות נרחבת, כפי שהם יכולים להיווצר על ידי פציעת פני השטח של cotyledons, ואחריו חיסון עם קנה שורש Agrobacterium⁷. A. rhizogenes מבטא גנים אלימים (Vir) המקודדים על ידי פלסמיד Ti שלו המעבירים, נושאים ומשלבים את מקטע T-DNA שלו בגנום של תאי צמח ובו זמנית ממריץ צמיחת שורשים חוץ רחמיים⁸.

בהשוואה למערכות ביטוי גנים אחרות של פולי סויה, כגון ביוליסטיקה או טרנספורמציה מבוססת A. tumefaciens של תרביות רקמות, תאים ואיברים, מערכת ביטוי HR מציגה מספר יתרונות. ראשית, HRs יציבים גנטית ומיוצרים במהירות על מדיה נטולת הורמונים ^1,9,10. בנוסף, HRs יכולים לייצר מטבוליטים מיוחדים בכמויות שוות ערך או גדולות יותר משורשים מקומיים^11,12. יתרונות אלה הופכים את HRs לכלי ביוטכנולוגי רצוי עבור מיני צמחים שאינם תואמים ל- A. tumefaciens או הזקוקים לתנאי תרבית רקמה מיוחדים כדי ליצור רקמות תואמות. שיטת HR היא גישה יעילה לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון, לוקליזציה תת-תאית של חלבונים, ייצור חלבונים רקומביננטיים, פיטו-רמדיציה, מוטגנזה והשפעות רחבות גנום באמצעות ריצוף RNA^13,14,15. זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את הייצור של מטבוליטים מיוחדים שיש להם ערך בתעשייה, כולל glyceollins, אשר תרופות ההגנה של סויה נגד הפתוגן המיקרוביאלי החשוב Phytophthora sojae ויש להם פעילויות אנטי סרטניות מרשימות neuroprotective בבני אדם^16,17.

דו"ח זה מדגים פרוטוקול קל ויעיל לייצור HRs פולי סויה. בהשוואה לשיטות טרנספורמציה קודמות של משאבי אנוש, פרוטוקול זה מספק שיפור משמעותי (33%-50%) בקצב היווצרות משאבי אנוש על ידי סינון מוקדם של טרנספורמנטים של A. rhizogenes לנוכחות פלסמיד Ti לפני חיסון cotyledons סויה. אנו מדגימים את הישימות של פרוטוקול זה על ידי טרנספורמציה של מספר וקטורים בינאריים המבטאים יתר על המידה או משתיקים גנים של פקטורי שעתוק פולי סויה.

Protocol

הערה: מומלץ שכל שלבי ההליך יתנהלו בתנאים סטריליים.

1. עיקור זרעי סויה

1. בארון בטיחות ביולוגית, הניחו 16-20 זרעי סויה עגולים במצב בתולי (כלומר, ללא סדקים או פגמים) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
2. מוסיפים 30 מ"ל של 70% אלכוהול איזופרופיל, מנערים בעדינות במשך 30 שניות, ולאחר מכן מרוקנים את האלכוהול.
3. נערו בעדינות את הזרעים עם 30 מ"ל של אקונומיקה 10% למשך 10 שניות ואפשרו לזרעים לשבת בתמיסה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT, 25°C). לאחר 5 דקות, מסננים את האקונומיקה.
4. יש לחזור על הניעור שלוש פעמים עם 30 מ"ל של H 2 O סטרילי טהור במיוחד למשךדקה אחת בכל שטיפה ולהשליך את H₂O בין כל שטיפה.
5. הניחו את הזרעים המעוקרים על נייר פילטר רווי ב-5 מ"ל של מדיום נביטה וגידול משותף (GC) (נוזל אוטוקלאבי בחצי חוזק מורשיגה וסקוג [MS] בינוני עם 1% סוכרוז [pH=5.8] ולאחר מכן הוסיפו 2.5 מ"ל/ליטר ויטמינים) בצלחות פטרי סטריליות.
6. מניחים את הצלחות בחושך ב RT (25 ° C) במשך 3 ימים לפני העברת הצלחות ב 22 ° C תחת 16 שעות לבן קריר T5 אורות פלואורסצנטי (100 μE ^m-2·s-1) במשך 4 ימים כדי לאפשר את הזרעים לנבוט.
   הערה: השליכו זרעים מקומטים או סדוקים. הזרעים הטובים ביותר הם אלה שהם גדולים וצהובים באופן אחיד. יש לעקר לפחות פי שניים ממספר הזרעים הדרוש לניסוי כדי לבחור זרעים באיכות טובה, מכיוון שזרעים מסוימים עשויים שלא להיות אופטימליים עקב נזק, מחלות או כישלון לנבוט.

2. זיהום של cotyledons עם K599

הערה: השתמש בווקטורים מסדרת pGWB, מכיוון שהברירה הכפולה שלהם מבטיחה אינטגרציה גנומית של קלטת T-DNA כולה. אלקטרופורציה שימשה להפיכת וקטור בינארי המכיל את הגן המעניין לקנה שורש A . pRi2659¹⁸.

1. בהתבסס על הרצף של A. rhizogenes pRi2659 plasmid¹⁸, לתכנן פריימרים כדי לזהות את הגן פלסמיד Ti VirD2 (VirD2 קדימה : 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 הפוך: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; גודל הגברה צפוי: 221 bp). לאחר הטרנספורמציה, בדוק את מושבות אגרובקטריום לשימור VirD2 על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות ערכת PCR (ראה טבלת חומרים). מחזור PCR: 94 °C למשך 3 דקות; 35 מחזורים (94°C למשך דקה אחת, 58°C למשך 30 שניות, 72°C למשך דקה אחת); ו 72 ° C במשך 10 דקות.
2. לאחר בחירת מושבת קני השורש A . המכילה גם את VirD2 וגם את הגן המעניין (GOI), פזרו חלק על לוחות בינוניים של לוריא-ברטאני (LB) המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה (50 מ"ג/ליטר) לפלסמיד המעניין ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. אם אתם משתמשים בספקטינומיצין, יש להוסיף ריכוז של 100 מ"ג/ליטר.
3. השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לגרד אורך ~ 1.5 ס"מ של K599 Agrobacterium מן לוחות LB ולהשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של חיץ פוספט (PB; 0.01 M Na₂HPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7.5).
4. לדלל את אגרובקטריום ב H₂O מעוקר וטהור במיוחד (v/v = 1: 1) ו acetosyringone (AS; 100 mM מלאי בדימתיל סולפוקסיד [DMSO], v/v = 1:1000). מדוד את הספיגה באמצעות צינור קובטה בצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600). הטווח האופטימלי הצפוי הוא בין 0.5 ל-0.8.
5. בארון בטיחות ביולוגית, טבלו אזמל מעוקר בתמיסת K599 Agrobacterium ובצעו מספר חתכים בעומק 1 מ"מ לאורך המשטח הפנימי (צד אדקסיאלי, שטוח) של הקוטיילדון. במהלך החיסון, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לייצב את הקוטיילדון.
6. מניחים כ-6-8 קוטילדונים חתוכים על צלחת פטרי המכילה נייר פילטר רווי במדיום GC עם AS.
   הערה: כדי להכין 6 צלחות, 50 מ"ל של מדיום GC ו 50 μL של 100 mM AS כדי להשיג ריכוז סופי של 100 μM מספיק.
7. לדגור על הצלחות ב RT (25 ° C) במשך 3 ימים תחת photoperiod 16 שעות (~ 65 μE).
8. העבירו את הקוטילדונים הנגועים לצלחות צמיחת שורשים שעירים (HRG) (טרשת נפוצה אוטוקלאבית בחצי חוזק עם 3% סוכרוז [pH = 5.8] ו-2.6 גרם/ליטר גלזן, ולאחר מכן הוסיפו תערובת ויטמינים של 2.5 מ"ל/ליטר ו-500 מ"ג/ליטר טימנטין).
   הערה: היו כמה בעיות עם timentin מכמה ספקים חלופיים, אשר K599 לא בוטל. מומלץ להשתמש בצלחות צלחת פטרי גבוהות יותר (100 מ"מ x 25 מ"מ) עבור מדיום HRG.
9. לדגור על לוחות HRG ב 22 ° C בתא צמיחה עם הפרמטרים להגדיר 100 μE אור על photoperiod 16 שעות עד שורשים ראשוניים עם שורשים משניים 2-3 ס"מ אורך נצפים (~ 3-4 שבועות).

3. בחירה וקציר של משאבי אנוש

1. קוצרים שורשים ראשוניים (5-7 ס"מ אורך) הצומחים מהיבלת ומכילים שורשים משניים (2-3 ס"מ אורך) באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים. מעבירים לבחירה צלחות HRG המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה. תן למשאבי אנוש לגדול במשך 5 ימים נוספים על צלחות HRG הבחירה.
   הערה: Kanamycin (50 מ"ג / ליטר), היגרומיצין (50 מ"ג / ליטר), או phosphinothricin (10 מ"ג / ליטר) משמשים בדרך כלל לבחירה. עבור וקטורי ביטוי, pGWB2 משמש לביטוי יתר, pANDA35HK משמש להשתקת RNAi, pGWB6 משמש ללוקליזציה תת-תאית, ו-pMDC7 משמש לביטוי אינדוקטיבי.
2. ביום החמישי, קוצרים HRs טרנסגניים עם שורשים משניים באורך 3-6 ס"מ. אם מתבוננים בחלבונים פלואורסצנטיים, לשורשים המשניים יש מעט אוטופלואורסצנטיות. אם אתם מבצעים טיפולים מעוררי השראה או כימיים, חתכו את השורשים המשניים לחתיכות של 1 ס"מ והניחו ~100 מ"ג על אגר HRG בערימה. לאחר מכן, להרוות את הערימות עם 80 μL של הטיפול המתאים ולאפשר את הצלחות לדגור ב RT (25 ° C).
3. לאחר זמן הטיפול הרצוי, להמשיך עם RNA או מיצוי מטבוליטים.
4. עבור RNA, לטפוח במהירות את השורשים יבש על מגבת נייר מעוקר ולקצור אותם ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.
5. מיד לאטום את החלק העליון של הצינור באמצעות parafilm, לעשות שני חורים קטנים באמצעות מלקחיים מחודדים, לטבול את הצינורות בחנקן נוזלי. Lyophilize במשך 3 ימים, ולאחר מכן לאחסן את הדגימות ב -80 ° C.
   הערה: חיוני לבחור משאבי אנוש לבנים. לאחר 5 ימים של צמיחה על הצלחת הסלקטיבית, HRs טרנסגניים יישארו לבנים, אך שורשים שאינם מהונדסים יהפכו חומים.

תוצאות

התוצאות המייצגות הן מתוך הנתונים שפורסמו ^19,20. תוצאות PCR (cPCR) של K599 Agrobacterium שעבר טרנספורמציה מוצגות באיור 1. כפי שמצוין על-ידי המושבות החיוביות באיור 1, הגן המעניין זוהה על-ידי cPCR (איור 1A). אולם שליש עד מחצית מ?...

Discussion

במהלך העשור האחרון, שיטת HR סויה פותחה ככלי רב עוצמה לחקר גנים המעורבים בקיבוע חנקן 22,23, עמידות לעקה ביוטית וא-ביוטית 24,25, ומסלולים ביוסינתטיים מטבוליטים ^26,27. לידע על האופן שבו צמחים מייצרים מטבו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010