АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол высокоэффективного производства трансгенных волосатых корней сои.

Аннотация

Соя (Glycine max) является ценной культурой в сельском хозяйстве, которая имеет тысячи промышленных применений. Корни сои являются основным местом взаимодействия с почвенными микробами, которые образуют симбиоз для фиксации азота и патогенов, что делает исследования, связанные с генетикой корней сои, первостепенной важностью для улучшения ее сельскохозяйственного производства. Генетическая трансформация волосатых корней сои (HRs) опосредована штаммом Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) и является эффективным инструментом для изучения функции генов в корнях сои, занимая всего 2 месяца от начала до конца. Здесь мы приводим подробный протокол, в котором описывается метод сверхэкспрессии и подавления гена, представляющего интерес для HR сои. Эта методология включает стерилизацию семян сои, заражение семядолей K599, а также отбор и сбор генетически трансформированных HR для выделения РНК и, при необходимости, анализа метаболитов. Пропускная способность подхода достаточна для одновременного изучения нескольких генов или сетей и может определить оптимальные инженерные стратегии до перехода к долгосрочным подходам к стабильной трансформации.

Введение

Соя (Glycine max) является одной из самых ценных культур в сельском хозяйстве. Он имеет тысячи коммерческих и промышленных применений, таких как продукты питания, корма для животных, масло, а также в качестве источника сырья для производства1. Его способность формировать симбиотические отношения с азотфиксирующими почвенными микроорганизмами, а именно ризобиями, еще больше повышает важность изучения генетики сои2. Например, тонкая настройка азотфиксирующих свойств в корнях сои может привести к сокращению выбросов углерода и значительно снизить потребность в азотных удобрениях3. Таким образом, понимание генетики, которая контролирует аспекты биологии корня сои, в частности, имеет широкое применение в сельском хозяйстве и промышленности. Учитывая эти преимущества, важно иметь надежный протокол для анализа функции генов сои.

Agrobacterium tumefaciens, пожалуй, является наиболее часто используемым инструментом для генетической трансформации растений, поскольку он обладает способностью интегрировать транспортную ДНК (Т-ДНК) в ядерный геном многих видов растений. Когда Agrobacterium заражает растение, она переносит индуцирующую опухоль (Ti) плазмиду в хромосому хозяина, что приводит к образованию опухоли в месте заражения. Трансформация, опосредованная агробактериями, широко использовалась в течение десятилетий для функционального анализа генов и для модификации признаков сельскохозяйственных культур4. Хотя любой интересующий ген может быть легко перенесен в клетки растений-хозяев посредством опосредованной A. tumefaciens трансформации, этот метод имеет несколько недостатков; Это отнимает много времени, дорого и требует обширных знаний для многих видов растений, таких как соя. Хотя несколько сортов сои могут быть преобразованы с помощью подхода семядольного узла с использованием A. tumefaciens, неэффективность этого подхода обуславливает необходимость в альтернативной технологии генетической трансформации, которая является быстрой и высокоэффективной 4,5. Даже неспециалист может использовать этот метод трансформации волосатого корня (HR), опосредованного Agrobacterium rhizogenes, чтобы преодолеть эти недостатки.

Трансформация HR является относительно быстрым инструментом не только для анализа функции генов, но и для биотехнологических применений, таких как производство специализированных метаболитов и тонких химикатов, а также сложных биологически активных гликопротеинов6. Производство HR сои не требует обширных знаний, так как они могут быть получены путем ранения поверхностей семядолей с последующей инокуляцией Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes экспрессирует гены вирулентности (Vir), кодируемые его плазмидой Ti, которые переносят, переносят и интегрируют сегмент Т-ДНК в геном растительных клеток, одновременно стимулируя рост эктопических корней8.

По сравнению с другими системами экспрессии генов сои, такими как биолистика или трансформация культур тканей, клеток и органов на основе A. tumefaciens, система экспрессии HR обладает рядом преимуществ. Во-первых, HR генетически стабильны и быстро продуцируются на безгормональных средах 1,9,10. Кроме того, HR могут продуцировать специализированные метаболиты в количествах, эквивалентных или превышающих родные корни11,12. Эти преимущества делают HR желательным биотехнологическим инструментом для видов растений, которые несовместимы с A. tumefaciens или которым требуются особые условия культивирования тканей для формирования совместимых тканей. Метод HR является эффективным подходом к анализу белково-белковых взаимодействий, субклеточной локализации белка, продукции рекомбинантного белка, фиторемедиации, мутагенеза и полногеномных эффектов с использованием секвенирования РНК13,14,15. Он также может быть использован для изучения производства специализированных метаболитов, имеющих ценность в промышленности, включая глицеоллины, которые защищают сою от важного микробного патогена Phytophthora sojae и обладают впечатляющей противоопухолевой и нейропротекторной активностью у человека16,17.

В этом отчете демонстрируется простой и эффективный протокол производства HR сои. По сравнению с предыдущими методами трансформации HR этот протокол обеспечивает значительное (33-50%) улучшение скорости формирования HR за счет предварительного скрининга трансформантов A. rhizogenes на наличие плазмиды Ti перед инокуляцией семядолей сои. Мы демонстрируем применимость этого протокола, трансформируя несколько бинарных векторов, которые сверхэкспрессируют или подавляют гены фактора транскрипции сои.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы все процессуальные действия проводились в стерильных условиях.

1. Стерилизация семян сои

  1. В шкаф биобезопасности поместите 16-20 круглых семян сои Williams 82 в первозданном состоянии (т. е. без трещин или пятен) в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  2. Добавьте 30 мл 70% изопропилового спирта, осторожно встряхните в течение 30 с, а затем сцедите спирт.
  3. Осторожно встряхните семена с 30 мл 10% отбеливателя в течение 10 с и оставьте семена в растворе на 5 минут при комнатной температуре (RT, 25 °C). Через 5 минут слейте отбеливатель.
  4. Повторите встряхивание три раза с 30 мл стерильного сверхчистого H 2 O в течение1 минуты на полоскание и выбрасывайте H2O между каждым полосканием.
  5. Стерилизованные семена поместить на фильтровальную бумагу, насыщенную 5 мл среды для проращивания и совместного культивирования (GC) (автоклавная жидкость половинной крепости Murashige и среда Skoog [MS] с 1% сахарозой [pH = 5,8], а затем добавьте 2,5 мл / л витаминов) в стерильные чашки Петри.
  6. Поместите пластины в темноту при RT (25 ° C) на 3 дня, прежде чем перенести пластины при 22 ° C под 16 ч холодно-белыми флуоресцентными лампами T5 (100 мкЭ м-2 · с-1) в течение 4 дней, чтобы дать семенам прорасти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте сморщенные или потрескавшиеся семена. Лучшими семенами считаются те, которые крупные и равномерно желтые. Стерилизуйте как минимум вдвое больше семян, необходимых для эксперимента, чтобы выбрать семена хорошего качества, так как некоторые семена могут быть неоптимальными из-за повреждений, болезней или непрорастания.

2. Заражение семядолей К599

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте векторы серии pGWB, так как их двойной отбор обеспечивает геномную интеграцию всей кассеты Т-ДНК. Электропорация была использована для преобразования бинарного вектора, содержащего интересующий ген, в A. rhizogenes pRi265918.

  1. На основе последовательности плазмиды18 A. rhizogenes pRi2659 разработаны праймеры для обнаружения гена плазмиды Ti VirD2 (VirD2 вперед: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; Реверс VirD2: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Ожидаемый размер усиления: 221.н.). После трансформации протестируйте колонии Agrobacterium на удержание VirD2 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора для ПЦР (см. Таблицу материалов). Цикл ПЦР: 94 °C в течение 3 мин; 35 циклов (94 °C в течение 1 мин, 58 °C в течение 30 сек, 72 °C в течение 1 мин); и 72 °C в течение 10 мин.
  2. После отбора колонии A. rhizogenes , содержащей как VirD2 , так и интересующий ген (GOI), выложите некоторые из них на средние планшеты Лурия-Бертани (LB), содержащие соответствующие антибиотики (50 мг / л) для интересующей плазмиды, и инкубируйте в течение ночи при 30 ° C. При использовании спектиномицина добавьте концентрацию 100 мг / л.
  3. С помощью наконечника пипетки P200 соскребите K599 Agrobacterium длиной ~ 1,5 см с планшетов LB и ресуспендируйте клетки в 1 мл фосфатного буфера (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
  4. Разведите Agrobacterium в стерилизованном сверхчистом H2O (v/v = 1:1) и ацетосирингоне (AS; 100 мМ в диметилсульфоксиде [ДМСО], v/v = 1:1000). Измерьте поглощение с помощью кюветной трубки при оптической плотности 600 нм (OD600). Ожидаемый оптимальный диапазон составляет от 0,5 до 0,8.
  5. В шкафу биобезопасности окуните стерилизованный скальпель в раствор K599 Agrobacterium и сделайте несколько надрезов глубиной 1 мм по внутренней поверхности (адаксиальная, плоская сторона) семядоли. Во время инокуляции используйте стерилизованные щипцы для стабилизации семядолей.
  6. Поместите около 6-8 семядолей, разрезанных стороной вниз, на чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу, насыщенную средой GC с AS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 6 планшетов достаточно 50 мл среды ГХ и 50 мкл 100 мМ АС для достижения конечной концентрации 100 мкМ.
  7. Инкубируйте планшеты при RT (25 °C) в течение 3 дней при 16-часовом фотопериоде (~65 мкВ).
  8. Перенесите зараженные семядоли на пластины для роста волосистых корней (HRG) (автоклавный МС половинной крепости с 3% сахарозой [pH = 5,8] и 2,6 г/л гельзана, затем добавьте смесь витаминов 2,5 мл/л и 500 мг/л тиментина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Были некоторые проблемы с тайментином от некоторых альтернативных поставщиков, из которых K599 не был устранен. Рекомендуется использовать более высокие тарелки чашки Петри (100 мм x 25 мм) для HRG medium.
  9. Инкубируйте пластины HRG при 22 °C в камере роста с параметрами, установленными на свет 100 мкЭ, в течение 16-часового фотопериода до тех пор, пока не будут наблюдаться первичные корни со вторичными корнями длиной 2-3 см (~3-4 недели).

3. Отбор и сбор кадров

  1. Заготавливают первичные корни (5-7 см в длину), которые растут из костной костли и содержат вторичные корни (2-3 см в длину), используя стерильный скальпель и щипцы. Переведите на отбор HRG планшеты, содержащие соответствующие антибиотики. Дайте HR расти еще 5 дней на отборных пластинах HRG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Канамицин (50 мг / л), гигромицин (50 мг / л) или фосфинотрицин (10 мг / л) обычно используются для отбора. Для векторов экспрессии pGWB2 используется для сверхэкспрессии, pANDA35HK используется для подавления РНК-интерференции, pGWB6 используется для субклеточной локализации, а pMDC7 используется для индуцируемой экспрессии.
  2. На 5 день заготавливают трансгенные HR со вторичными корнями длиной 3-6 см. При наблюдении за флуоресцентными белками вторичные корни имеют небольшую автофлуоресценцию. Если вы выполняете элиситорную или химическую обработку, разрежьте вторичные корни на кусочки по 1 см и поместите ~ 100 мг на агар HRG в кучу. Затем насытите сваи 80 мкл соответствующей обработки и дайте пластинам инкубироваться при RT (25 °C).
  3. По истечении желаемого времени лечения приступайте к экстракции РНК или метаболитов.
  4. Что касается РНК, быстро промокните корни сухими на стерилизованном бумажном полотенце и соберите их непосредственно в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
  5. Немедленно запечатайте верхнюю часть трубки с помощью парапленки, сделайте два небольших отверстия с помощью заостренных щипцов и погрузите трубки в жидкий азот. Лиофилизировать в течение 3 дней, затем хранить образцы при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно выбирать HR белого цвета. Через 5 дней роста на селективной пластинке трансгенные HR останутся белыми, а вот нетрансгенные корни станут коричневыми.

Результаты

Репрезентативные результаты взяты из опубликованных данных19,20. Результаты колонии ПЦР (цПЦР) трансформированной K599 Agrobacterium показаны на рисунке 1. Как видно из положительных колоний на рисунке 1, интересующий ген был о?...

Обсуждение

В течение последнего десятилетия был разработан метод HR сои в качестве мощного инструмента для изучения генов, участвующих в фиксации азота 22,23, биотической и абиотической стрессоустойчивости 24,25 и путях биосинтеза метаболитов 26,27.<...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) с номером гранта RGPIN-2020-06111 и щедрым пожертвованием Брэда Лейса. Мы хотели бы поблагодарить Уэйна Пэррота (Университет Джорджии) за K599 Agrobacterium и предварительный протокол, а также лабораторию Nakagawa & Hachiya (Университет Симанэ) за пустые векторы pGWB2, pGWB6 и pANDA35HK.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetosyringoneCayman23224
Bleachlavo21124
DMSOFisher bioreagents195679
GelzanPhytotechHYY3251089A
HygromycinPhytotechHHA0397050B
Isopropyl alcoholFisher chemical206462
KanamycinPhytotechSQS0378007G
LB powderFisher bioreagents200318
MS powderCaisson labs2210001
Na2HPO4Fisher bioreagents194171
NaClFisher chemical192946
Petri dishesFisherbrand08-757-11100 mm x 25 mm
PhosphinothricinCedarlaneP034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR KitSigmaR4775
SucroseBioshop2D76475
TimentinCaisson labs12222002
VitaminsCaisson labs2211010

Ссылки

  1. Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).
  2. Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619 (2020).
  3. Huang, X. -. F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
  4. Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).
  5. Hwang, H. -. H., Yu, M., Lai, E. -. M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).
  6. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
  7. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  8. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
  9. Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
  10. Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).
  11. Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
  12. Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261 (2017).
  13. Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).
  14. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
  15. Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).
  16. Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
  17. Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).
  18. Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
  19. Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545 (2023).
  20. Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
  21. Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149 (2019).
  22. Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171 (2021).
  23. Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
  24. Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170 (2021).
  25. Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
  26. Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
  27. Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118 (2022).
  28. Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
  29. Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195Agrobacterium rhizogenes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены