Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Özet

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Soya fasulyesi (Glycine max), binlerce endüstriyel kullanıma sahip tarımda değerli bir üründür. Soya fasulyesi kökleri, azot ve patojenleri sabitlemek için simbiyoz oluşturan toprak kaynaklı mikroplarla etkileşimin birincil bölgesidir ve bu da tarımsal üretimini geliştirmek için soya fasulyesi kökü genetiğini içeren araştırmaları birincil öneme sahiptir. Soya fasulyesi tüylü köklerinin (HR'ler) genetik dönüşümüne Agrobacterium rhizogenes suşu NCPPB2659 (K599) aracılık eder ve soya fasulyesi köklerindeki gen fonksiyonunu incelemek için baştan sona sadece 2 ay süren etkili bir araçtır. Burada, soya fasulyesi HR'lerinde ilgi çekici bir genin aşırı eksprese edilmesi ve susturulması için kullanılan yöntemi özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, soya fasulyesi tohumu sterilizasyonunu, kotiledonların K599 ile enfeksiyonunu ve RNA izolasyonu için genetik olarak dönüştürülmüş HR'lerin seçimini ve toplanmasını ve gerekirse metabolit analizlerini içerir. Yaklaşımın verimi, birkaç geni veya ağı aynı anda incelemek için yeterlidir ve uzun vadeli kararlı dönüşüm yaklaşımlarına geçmeden önce en uygun mühendislik stratejilerini belirleyebilir.

Giriş

Soya fasulyesi (Glycine max) tarımdaki en değerli ürünler arasındadır. Gıda, hayvan yemi, yağ gibi binlerce ticari ve endüstriyel kullanıma sahiptir ve üretim için hammadde kaynağı olarak¹. Azot sabitleyici toprak mikroorganizmalarıyla, yani rizobiya ile simbiyotik bir ilişki kurma yeteneği, soya fasulyesi genetiğinin incelenmesinin önemini daha da arttırmaktadır². Örneğin, soya fasulyesi köklerindeki azot fiksasyon özelliklerinin ince ayarlanması, karbon emisyonlarının azaltılmasına yol açabilir ve azotlu gübre³ gereksinimlerini büyük ölçüde azaltabilir. Bu nedenle, özellikle soya fasuly....

Protokol

NOT: Tüm işlem adımlarının steril koşullar altında yapılması önerilir.

1. Soya tohumu sterilizasyonu

1. Bir biyogüvenlik kabininde, 16-20 yuvarlak Williams 82 soya fasulyesi tohumunu bozulmamış durumda (yani çatlak veya leke yok) 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
2. 30 mL% 70 izopropil alkol ekleyin, 30 s boyunca hafifçe çalkalayın ve ardından alkolü boşaltın.
3. Tohumları 10 saniye boyunca 30 mL% 10 ağartıcı ile hafifçe çalkalayın ve tohumların oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) 5 dakika boyunca çözelti içinde oturmasına izin verin. 5 dakika sonra ağartıcıyı süzün.
4. Durulama başına 1 daki....

Tartışmalar

Son on yılda, soya fasulyesi HR yöntemi, azot fiksasyonu 22,23, biyotik ve abiyotik stres toleransı^24,25 ve metabolit biyosentetik yolakları^26,27'de yer alan genleri incelemek için güçlü bir araç olarak geliştirilmiştir. Bitkilerin metabolitleri nasıl ürettiklerine dair bilgi, tarımsal üretim ve ilaç endüstrisi için çok sayıda .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010