Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Zusammenfassung

Sojabohnen (Glycine max) sind eine wertvolle Nutzpflanze in der Landwirtschaft, die Tausende von industriellen Anwendungen hat. Sojabohnenwurzeln sind der primäre Ort der Interaktion mit bodenbürtigen Mikroben, die eine Symbiose eingehen, um Stickstoff und Krankheitserreger zu fixieren, was die Erforschung der Sojabohnenwurzelgenetik von größter Bedeutung für die Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktion macht. Die genetische Transformation von Sojabohnenwurzeln (HRs) wird durch den Agrobacterium rhizogenes-Stamm NCPPB2659 (K599) vermittelt und ist ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion in Sojabohnenwurzeln, das von Anfang bis Ende nur 2 Monate dauert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Methode zur Überexpression und zum Ausschalten eines Gens von Interesse in Sojabohnen-HRs beschreibt. Diese Methodik umfasst die Sterilisation von Sojabohnensaatgut, die Infektion von Keimblättern mit K599 sowie die Auswahl und Ernte genetisch transformierter HRs für die RNA-Isolierung und, falls erforderlich, Metabolitenanalysen. Der Durchsatz des Ansatzes reicht aus, um mehrere Gene oder Netzwerke gleichzeitig zu untersuchen und könnte die optimalen Engineering-Strategien bestimmen, bevor man sich auf langfristig stabile Transformationsansätze festlegt.

Einleitung

Sojabohnen (Glycine max) gehören zu den wertvollsten Nutzpflanzen in der Landwirtschaft. Es hat Tausende von kommerziellen und industriellen Verwendungszwecken, wie z. B. Lebensmittel, Tierfutter, Öl und als Rohstoffquelle für die Herstellung¹. Seine Fähigkeit, eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenmikroorganismen, insbesondere Rhizobien, einzugehen, erhöht die Bedeutung der Untersuchung der Sojabohnengenetik^{weiter 2}. So kann beispielsweise die Feinabstimmung der Stickstofffixierungseigenschaften in Sojabohnenwurzeln zu einer Verringerung der Kohlenstoffemissionen führen und den Bedarf an Stickstoffdünger erheblich senken³. Daher hat das Verständnis der Genetik, die insbesondere Aspekte der Biologie der Sojabohnenwurzel steuert, breite Anwendungen in der Landwirtschaft und Industrie. In Anbetracht dieser Vorteile ist es wichtig, ein zuverlässiges Protokoll zur Analyse der Funktion von Sojabohnengenen zu haben.

Agrobacterium tumefaciens ist vielleicht das am häufigsten verwendete Werkzeug für die genetische Transformation von Pflanzen, da es in der Lage ist, Transfer-DNA (T-DNA) in das Kerngenom vieler Pflanzenarten zu integrieren. Wenn Agrobacterium eine Pflanze infiziert, überträgt es das tumorinduzierende (Ti) Plasmid in das Wirtschromosom, was zur Bildung eines Tumors an der Infektionsstelle führt. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird seit Jahrzehnten häufig für die Genfunktionsanalyse und zur Modifikation von Pflanzenmerkmalen eingesetzt⁴. Obwohl jedes interessierende Gen durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation leicht in Wirtspflanzenzellen übertragen werden kann, hat diese Methode mehrere Nachteile. Es ist zeitaufwändig, teuer und erfordert für viele Pflanzenarten, wie z. B. Sojabohnen, umfangreiches Fachwissen. Obwohl einige Sojabohnensorten durch den Keimblattknotenansatz unter Verwendung von A. tumefaciens transformiert werden können, erfordert die Ineffizienz dieses Ansatzes die Notwendigkeit einer alternativen genetischen Transformationstechnologie, die schnell und hocheffizient ist ^4,5. Auch ein Laie kann diese Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Haarwurzel-Transformationsmethode (HR) anwenden, um diese Nachteile zu überwinden.

Die HR-Transformation ist ein relativ schnelles Werkzeug, nicht nur für die Analyse der Genfunktion, sondern auch für biotechnologische Anwendungen, wie die Herstellung von spezialisierten Metaboliten und Feinchemikalien sowie komplexer bioaktiver Glykoproteine⁶. Die Herstellung von Sojabohnen-HRs erfordert kein umfangreiches Fachwissen, da sie durch Verwundung der Oberflächen von Keimblättern und anschließender Inokulation mit Agrobacterium rhizogenes⁷ erzeugt werden können. A. rhizogenes exprimiert Virulenzgene (Vir), die durch sein Ti-Plasmid kodiert werden, das seinen T-DNA-Abschnitt in das Genom von Pflanzenzellen überträgt, trägt und integriert und gleichzeitig das Wachstum der ektopischen Wurzeln stimuliert⁸.

Im Vergleich zu anderen Genexpressionssystemen für Sojabohnen, wie z. B. der Biolistik oder der A. tumefaciens-basierten Transformation von Gewebe-, Zell- und Organkulturen, weist das HR-Expressionssystem mehrere Vorteile auf. Erstens sind HRs genetisch stabil und werden schnell auf hormonfreien Medien produziert ^1,9,10. Darüber hinaus können HRs spezialisierte Metaboliten in Mengen produzieren, die den nativen Wurzeln entsprechen oder diese überschreiten^11,12. Diese Vorteile machen HRs zu einem wünschenswerten biotechnologischen Werkzeug für Pflanzenarten, die mit A. tumefaciens nicht kompatibel sind oder die spezielle Gewebekulturbedingungen benötigen, um kompatible Gewebe zu bilden. Die HR-Methode ist ein effizienter Ansatz zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, der subzellulären Lokalisierung von Proteinen, der rekombinanten Proteinproduktion, der Phytoremediation, der Mutagenese und genomweiten Effekten unter Verwendung der RNA-Sequenzierung^13,14,15. Es kann auch verwendet werden, um die Produktion spezialisierter Metaboliten zu untersuchen, die in der Industrie von Wert sind, einschließlich Glyceollinen, die die Abwehr von Sojabohnen gegen den wichtigen mikrobiellen Krankheitserreger Phytophthora sojae behandeln und beim Menschen beeindruckende krebshemmende und neuroprotektive Wirkungen haben^16,17.

Dieser Bericht demonstriert ein einfaches, effizientes Protokoll zur Herstellung von HRs für Sojabohnen. Im Vergleich zu früheren HR-Transformationsmethoden bietet dieses Protokoll eine signifikante (33%-50%) Verbesserung der HR-Bildung, indem A. rhizogenes-Transformanten vor der Inokulation von Sojabohnen-Keimblättern auf das Vorhandensein des Ti-Plasmids voruntersucht werden. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls, indem wir mehrere binäre Vektoren transformieren, die Sojabohnen-Transkriptionsfaktor-Gene überexprimieren oder stilllegen.

Protokoll

Anmerkungen: Es wird empfohlen, alle weiteren Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen.

1. Sterilisation von Sojabohnensamen

1. Legen Sie in einer Biosicherheitswerkbank 16-20 runde Williams 82-Sojabohnensamen in makellosem Zustand (d. h. ohne Risse oder Schönheitsfehler) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 30 ml 70%igen Isopropylalkohol hinzu, schütteln Sie ihn 30 Sekunden lang vorsichtig und dekantieren Sie dann den Alkohol.
3. Schütteln Sie die Samen vorsichtig mit 30 ml 10%iger Bleichmittel für 10 s und lassen Sie die Samen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) in der Lösung ruhen. Nach 5 Minuten das Bleichmittel abtropfen lassen.
4. Wiederholen Sie das Schütteln dreimal mit 30 ml sterilem hochreinem H2O für 1 Minute pro Spülgang und entsorgen Sie das_H2Ozwischen jedemSpülgang.
5. Legen Sie die sterilisierten Samen auf Filterpapier, das mit 5 ml Keimungs- und Cokultivierungsmedium (GC) (Autoklav, halbstarke Flüssigkeit, Murashige- und Skoog [MS]-Medium mit 1% Saccharose [pH = 5,8] getränkt ist, und fügen Sie dann 2,5 ml/l Vitamine) in sterile Petrischalen hinzu.
6. Stellen Sie die Platten 3 Tage lang bei RT (25 °C) im Dunkeln, bevor Sie die Platten bei 22 °C unter 16 h kaltweißer T5-Leuchtstoffröhre (100 μE ^m-2·s-1) für 4 Tage umfüllen, damit die Samen keimen können.
   Anmerkungen: Entsorgen Sie zerknitterte oder rissige Samen. Die besten Samen sind diejenigen, die groß und gleichmäßig gelb sind. Sterilisieren Sie mindestens die doppelte Anzahl von Samen, die für das Experiment erforderlich sind, um Samen von guter Qualität auszuwählen, da einige Samen aufgrund von Schäden, Krankheiten oder Nichtkeimung möglicherweise nicht optimal sind.

2. Infektion der Keimblätter mit K599

HINWEIS: Verwenden Sie Vektoren der pGWB-Serie, da deren duale Selektion die genomische Integration der gesamten T-DNA-Kassette gewährleistet. Mittels Elektroporation wurde ein binärer Vektor, der das interessierende Gen enthält , in A. rhizogenes pRi2659 umgewandelt¹⁸.

1. Basierend auf der Sequenz des Plasmids¹⁸ von A. rhizogenes pRi2659 wurden Primer zum Nachweis des Ti-Plasmidgens VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 umgekehrt: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Erwartete Verstärkungsgröße: 221 bp). Nach der Transformation werden die Agrobacterium-Kolonien mit einem PCR-Kit auf die Retention von VirD2 mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) getestet (siehe Materialtabelle). PCR-Zyklus: 94 °C für 3 min; 35 Zyklen (94 °C für 1 Minute, 58 °C für 30 Sek., 72 °C für 1 Minute); und 72 °C für 10 min.
2. Nach der Auswahl der A. rhizogenes-Kolonie , die sowohl VirD2 als auch das interessierende Gen (GOI) enthält, werden einige Platten auf Luria-Bertani (LB)-Platten, die die entsprechenden Antibiotika (50 mg/L) für das interessierende Plasmid enthalten, gestreift und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Wenn Sie Spectinomycin verwenden, fügen Sie eine Konzentration von 100 mg/l hinzu.
3. Verwenden Sie eine P200-Pipettenspitze, um eine ~1,5 cm lange Länge des K599 Agrobacterium von den LB-Platten abzukratzen, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Phosphatpuffer (PB; 0,01 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
4. Das Agrobakterium wird in sterilisiertem, hochreinem_H2O(v/v = 1:1) und Acetosyringon (AS; 100 mM Vorrat an Dimethylsulfoxid [DMSO], v/v = 1:1000) verdünnt. Messen Sie die Absorption mit einer Küvettenröhre bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD600). Der erwartete optimale Bereich liegt zwischen 0,5 und 0,8.
5. Tauchen Sie in einer Biosicherheitswerkbank ein sterilisiertes Skalpell in die K599 Agrobacterium-Lösung und machen Sie mehrere 1 mm tiefe Schnitte entlang der Innenfläche (adaxial, flache Seite) des Keimblatts. Verwenden Sie während der Impfung eine sterilisierte Pinzette, um das Keimblatt zu stabilisieren.
6. Legen Sie etwa 6-8 Keimblätter mit der Schnittseite nach unten auf eine Petrischale mit Filterpapier, das mit GC-Medium mit AS getränkt ist.
   Anmerkungen: Für die Herstellung von 6 Platten sind 50 ml GC-Medium und 50 μl 100 mM AS ausreichend, um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen.
7. Inkubieren Sie die Platten bei RT (25 °C) für 3 Tage unter einer 16-stündigen Photoperiode (~65 μE).
8. Übertragen Sie die infizierten Keimblätter auf haarige Wurzelwachstumsplatten (HRG) (Autoklav halbstarke MS mit 3% Saccharose [pH = 5,8] und 2,6 g/L Gelzan, dann 2,5 ml/l Vitaminmischung und 500 mg/L Timentin).
   HINWEIS: Es gab einige Probleme mit Timentin von einigen alternativen Anbietern, von denen der K599 nicht beseitigt wurde. Es wird empfohlen, höhere Petrischalen (100 mm x 25 mm) für HRG-Medium zu verwenden.
9. Inkubieren Sie die HRG-Platten bei 22 °C in einer Wachstumskammer mit den Parametern auf 100 μE Licht bei einer 16-stündigen Photoperiode, bis Primärwurzeln mit Sekundärwurzeln von 2-3 cm Länge beobachtet werden (~3-4 Wochen).

3. Auswahl und Ernte von HRs

1. Ernten Sie Primärwurzeln (5-7 cm lang), die aus der Hornhaut wachsen und Sekundärwurzeln (2-3 cm lang) enthalten, mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette. Übertragen Sie auf ausgewählte HRG-Platten, die die entsprechenden Antibiotika enthalten. Lassen Sie die HRs noch 5 Tage auf den ausgewählten HRG-Platten wachsen.
   HINWEIS: Kanamycin (50 mg/l), Hygromycin (50 mg/l) oder Phosphinothricin (10 mg/l) werden in der Regel zur Auswahl verwendet. Für Expressionsvektoren wird pGWB2 für die Überexpression, pANDA35HK für das RNAi-Silencing, pGWB6 für die subzelluläre Lokalisation und pMDC7 für die induzierbare Expression verwendet.
2. Ernten Sie an Tag 5 transgene HRs mit Sekundärwurzeln von 3-6 cm Länge. Bei der Beobachtung fluoreszierender Proteine weisen die Sekundärwurzeln wenig Autofluoreszenz auf. Wenn Sie Elizitor oder chemische Behandlungen durchführen, schneiden Sie die Sekundärwurzeln in 1 cm große Stücke und legen Sie ~100 mg auf HRG-Agar auf einen Haufen. Tränken Sie dann die Stapel mit 80 μl der entsprechenden Behandlung und lassen Sie die Platten bei RT (25 °C) inkubieren.
3. Fahren Sie nach der gewünschten Behandlungszeit mit der Extraktion von RNA oder Metaboliten fort.
4. Für RNA tupfen Sie die Wurzeln schnell auf einem sterilisierten Papiertuch trocken und ernten Sie sie direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Versiegeln Sie die Oberseite der Tube sofort mit Parafilm, bohren Sie zwei kleine Löcher mit einer spitzen Pinzette und tauchen Sie die Röhren in flüssigen Stickstoff. 3 Tage gefriertrocknen, dann die Proben bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Es ist wichtig, HRs auszuwählen, die weiß sind. Nach 5 Tagen Wachstum auf der selektiven Platte bleiben transgene HRs weiß, aber nicht-transgene Wurzeln werden braun.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus den veröffentlichten Daten^19,20. Die Ergebnisse der Kolonie-PCR (cPCR) des transformierten K599 Agrobacterium sind in Abbildung 1 dargestellt. Wie die positiven Kolonien in Abbildung 1 zeigen, wurde das interessierende Gen mittels cPCR nachgewiesen (Abbildung 1A). Ein Drittel bis die Hälfte der Kolonien waren jedoch nega...

Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde die HR-Methode der Sojabohne als leistungsfähiges Werkzeug entwickelt, um Gene zu untersuchen, die an der Stickstofffixierung 22,23, der biotischen und abiotischen Stresstoleranz ^24,25 und den Biosynthesewegen von Metaboliten beteiligt sind ^26,27. Das Wissen darüber, wie Pflanzen Metaboliten produzieren, hat eine...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010