Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Zusammenfassung

Sojabohnen (Glycine max) sind eine wertvolle Nutzpflanze in der Landwirtschaft, die Tausende von industriellen Anwendungen hat. Sojabohnenwurzeln sind der primäre Ort der Interaktion mit bodenbürtigen Mikroben, die eine Symbiose eingehen, um Stickstoff und Krankheitserreger zu fixieren, was die Erforschung der Sojabohnenwurzelgenetik von größter Bedeutung für die Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktion macht. Die genetische Transformation von Sojabohnenwurzeln (HRs) wird durch den Agrobacterium rhizogenes-Stamm NCPPB2659 (K599) vermittelt und ist ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion in Sojabohnenwurzeln, das von Anfang bis Ende nur 2 Monate dauert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Methode zur Überexpression und zum Ausschalten eines Gens von Interesse in Sojabohnen-HRs beschreibt. Diese Methodik umfasst die Sterilisation von Sojabohnensaatgut, die Infektion von Keimblättern mit K599 sowie die Auswahl und Ernte genetisch transformierter HRs für die RNA-Isolierung und, falls erforderlich, Metabolitenanalysen. Der Durchsatz des Ansatzes reicht aus, um mehrere Gene oder Netzwerke gleichzeitig zu untersuchen und könnte die optimalen Engineering-Strategien bestimmen, bevor man sich auf langfristig stabile Transformationsansätze festlegt.

Einleitung

Sojabohnen (Glycine max) gehören zu den wertvollsten Nutzpflanzen in der Landwirtschaft. Es hat Tausende von kommerziellen und industriellen Verwendungszwecken, wie z. B. Lebensmittel, Tierfutter, Öl und als Rohstoffquelle für die Herstellung¹. Seine Fähigkeit, eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenmikroorganismen, insbesondere Rhizobien, einzugehen, erhöht die Bedeutung der Untersuchung der Sojabohnengenetik^{weiter 2}. So kann beispielsweise die Feinabstimmung der Stickstofffixierungseigenschaften in Sojabohnenwurzeln zu einer Verringerung der Kohlenstoffemissionen führen und den Bedarf an St....

Protokoll

Anmerkungen: Es wird empfohlen, alle weiteren Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen.

1. Sterilisation von Sojabohnensamen

1. Legen Sie in einer Biosicherheitswerkbank 16-20 runde Williams 82-Sojabohnensamen in makellosem Zustand (d. h. ohne Risse oder Schönheitsfehler) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 30 ml 70%igen Isopropylalkohol hinzu, schütteln Sie ihn 30 Sekunden lang vorsichtig und dekantieren Sie dann den Alkohol.
3. Schütteln Sie die Samen vorsichtig mit 30 ml 10%iger Bleichmittel für 10 s und lassen Sie die Samen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) in der Lös....

Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde die HR-Methode der Sojabohne als leistungsfähiges Werkzeug entwickelt, um Gene zu untersuchen, die an der Stickstofffixierung 22,23, der biotischen und abiotischen Stresstoleranz ^24,25 und den Biosynthesewegen von Metaboliten beteiligt sind ^26,27. Das Wissen darüber, wie Pflanzen Metaboliten produzieren, hat eine.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010