基于脂质UNet-机器学习的脂质沉积物使用iPSC衍生的视网膜色素上皮表征和定量脂质沉积物的方法

摘要

影响眼睛视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。已经开发了几种疾病模型和软件应用程序LipidUNet来研究疾病的机制以及潜在的治疗干预措施。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是位于眼睛后部的单层六角形细胞。它为光感受器和脉络膜毛细血管提供营养和支持，对感光器外段（POS）进行吞噬作用，并以极化方式分泌细胞因子以维持外视网膜的稳态。由突变、衰老和环境因素引起的功能失调的 RPE 会导致其他视网膜层退化并导致视力丧失。退化 RPE 的一个标志性表型特征是细胞内和亚细胞内富含脂质的沉积物。这些沉积物是不同视网膜退行性疾病的共同表型。为了在 体外重现单基因视网膜变性的脂质沉积表型，从患者的成纤维细胞中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE（iRPE）。Stargardt和迟发性视网膜变性（L-ORD）患者产生的细胞系用POS喂养7天以复制RPE生理功能，这在这些疾病中引起了POS吞噬诱导的病理。为了生成年龄相关性黄斑变性（AMD）的模型，这是一种与替代补体激活相关的多基因疾病，iRPE受到替代补体过敏毒素的挑战。使用尼罗河红、硼-二吡咯甲烷（BODIPY）和载脂蛋白E（APOE）对细胞内和亚细胞脂质沉积物进行了表征。为了量化脂质沉积物的密度，开发了一种基于机器学习的软件LipidUNet。该软件在培养表面上对iRPE的最大强度投影图像进行了训练。将来，它将被训练来分析三维（3D）图像并量化脂滴的体积。LipidUNet软件将成为发现减少疾病模型中脂质积累的药物的宝贵资源。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是位于眼睛后部与视网膜感光器相邻的单层细胞。RPE通过为光感受器提供代谢和结构支持，在维持正常视力方面起着至关重要的作用。健康的RPE细胞具有独特的六边形形态。它们通过紧密的连接连接，这使得RPE能够充当位于其基底侧的绒毛细血管和位于顶端的光感受器之间的屏障。为了维持视网膜生态系统，RPE 将关键代谢物（例如葡萄糖）运送到光感受器，以最大限度地减少 RPE 中的葡萄糖消耗¹。由于这种限制，RPE依赖于其他代谢物来维持其代谢需求，包括脂肪酸，RPE通过β氧化将其转化为酮²。鉴于 RPE 倾向于利用脂肪酸（可能从感光器外段 （POS） 消化中回收）作为能量来源，RPE 中脂质加工途径的有害变化通常会导致或与单基因和多基因退行性视网膜疾病有关³。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致RPE变性的多基因退行性眼病，也与RPE单层中的异常自噬和脂质代谢有关。功能失调的RPE单层无法处理POS和执行其他关键功能，导致细胞外（亚RPE）沉积，称为基础线性沉积物（BLinD），位于RPE和Bruch膜之间 - 这是AMD病理学的标志。BLinD的主要成分包括脂蛋白，其中最丰富的是载脂蛋白E（APOE）⁴。BLinD薄层的积累会导致软玻璃膜疣，这被认为是AMD^5，6的临床症状。

一些小组已经表明，导致RPE功能障碍的干细胞衍生体外疾病模型具有亚RPE脂质积累⁷，^8，9。Hallam等人（2017）由于CFH基因的多态性，从AMD高风险患者中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE（iRPE）。iRPE显示玻璃膜疣积累，如APOE为标志，高风险RPE积累的沉积物大于低风险患者产生的iRPE10。

为了创建一个体 外 模型来概括AMD的细胞特征，如脂滴和玻璃膜疣沉积，使用先前发表的发育指导方案¹¹建立了从患者血液样本生成的iRPE系。iRPE接受补体感受能力人血清（CC-HS），这是一种含有过敏毒素的溶液，模仿AMD的一个可能原因：增加替代补体信号传导⁸。使用常用的脂质和脂蛋白标记物APOE，尼罗河红和BODIPY测量产生的脂质沉积物的细胞和亚细胞沉积。通过这些标记物，显示通过CC-HS激活的补体信号传导加剧了iRPE细胞中的脂质积累⁸。

为了开发单基因视网膜退行性疾病的疾病模型，从Stargardt病患者开发了iRPE系，Stargardt病是一种由RPE中 ABCA4 基因突变引起的疾病。先前已经表明，当 ABCA4 被敲除时，A2E脂褐素（一种已知含有高水平磷脂和光依赖性脂质过氧化产物的细胞内沉积物）积聚在RPE¹²内。 ABCA4 敲除线与患者线一起开发，并且两者都经过 POS 喂养。Stargardt iRPE显示出POS吞噬作用诱导的病理学，表现出通过BODIPY染色定量的脂质积累增加。来源于 ABCA4 KO iPSCs的RPE进行CC-HS处理;BODIPY信号的定量显示Stargardt病模型中脂质处理存在缺陷⁹。

鉴于这些疾病的流行和对有效疗法的需求，以及上述相关疾病模型，有必要建立强有力的方法来量化潜在治疗的疗效。为了以客观、自动化和标准化的方式量化脂质沉积，我们创建了一个基于机器学习的软件 LipidUNet，以便与掩模分析工具配合使用时，可以使用常见的标记尼罗河红、BODIPY 和 APOE 快速有效地识别脂质沉积。然后可以分析和以图形方式分析和显示使用该分析管道获得的汇总统计数据，从而可以轻松比较治疗条件。该协议的原理图如图 1所示。

图 1：方案示意图：RPE 细胞在 96 孔板上生长，并用活性人血清或纯化的牛外段攻击，以在体外模拟不同类型的视网膜变性。将RPE细胞固定并染色，以观察尼罗河红，BODIPY和APOE的脂蛋白沉积物。共聚焦显微镜用于获取荧光标记的脂质颗粒的Z堆栈，随后将其处理成2D最大强度投影。训练机器学习算法来识别和正确分割脂蛋白颗粒。生成包含颗粒计数和各种形状指标的汇总表，可用于后续绘图和统计分析。请点击此处查看此图的大图。

研究方案

所有方案步骤均遵循NIH人类研究伦理委员会制定的指导方针。根据美国政府的45 CFR 46指南，干细胞工作和患者样本采集已获得NIH人类研究保护办公室（OHRP）下属的联合神经科学机构审查委员会（CNS IRB）的批准。根据赫尔辛基宣言规定的标准，使用CNS IRB批准的同意书收集患者样本，协议号为NCT01432847（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1）。

1. iRPE 生成

1. 按照 Sharma 等人发表的方案从患者血液来源的 iPSC 中生成 iRPE，2022¹¹ （图 2 和 图 3）。

图 2：iRPE 分化和成熟的示意图。 为了产生iRPE，遵循既定的分化方案，并使细胞成熟5周。由此产生的细胞培养物充当体 外 模型，可以通过各种治疗方法进行操作，以模拟AMD和Stargardt病等疾病的RPE功能障碍。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：成功和不成功的 RPE 分化和成熟的代表性图像。 在 iRPE 方案的第 42 天显示了 TJP1 RPE 10 倍放大倍率下的两个明场图像。（A）成功的分化和成熟将显示出与色素沉着和多边形形态的融合RPE。（B）不成功的分化和成熟将显示死亡细胞的簇，如图所示。 请点击此处查看此图的大图。

2. RPE 维护培养基 （RPE-MM） 制备

1. 将N 2补充剂在4°C下解冻过夜。在室温（RT）下解冻所有其他试剂。
2. 在无菌条件下，按照Sharma等人制定的方案，按照Sharma等人制定的方案，以列出的稀释因子加入 表1 中列出的试剂¹¹¹。
3. 充分混合培养基并使用0.22μm过滤装置进行过滤。
   注意：如果储存在4°C，培养基适合在2周内使用。

3. 96孔板播种

1. 在室温下解冻等分试样玻连蛋白3-5分钟或直到冰完全融化。
2. 用1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）稀释玻连蛋白，以使用1：200稀释度（玻连蛋白：DPBS）获得所需的工作溶液。对于 96 孔板，在每个孔中涂上 200 μL 工作溶液。
3. 将解冻的ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）与RPE-MM以1：1000稀释度混合，以达到10μM的最终浓度。这是RPE细胞的电镀介质。
4. 使用自动细胞解冻系统解冻iRPE小瓶，并将iRPE细胞悬液转移到50 mL管中。
5. 用电镀介质以1：10稀释度稀释细胞悬液。将试管以400× g 离心5分钟。
6. 小心吸出上清液并将细胞重悬于10mL电镀介质中。
7. 将 400 μL 电镀介质与 100 μL 重悬细胞溶液混合以进行细胞计数。使用该等分试样使用细胞活力计数器确定细胞悬液的活细胞浓度。
8. 用电镀培养基稀释细胞悬液至终浓度为60，000个细胞/ mL。
9. 从 96 孔板中完全吸出玻连蛋白包衣溶液，并将 200 μL 细胞悬液分配到每个孔中。将有大约 12，000 个细胞/孔或 ~200 个细胞/mm²。
10. 将接种的细胞板在37°C和5%CO₂下孵育48小时。48小时后，将培养基更换为RPE-MM，无需补充ROCK抑制剂。在 5 周的成熟期内，每 2-3 天更换一次培养基。

4. 体外 疾病模型

1. 补体感受态人血清 （CC-HS） 治疗
   1. 将人补体感受态血清在 4°C 下解冻过夜。
   2. 制备 CC-HS 并补体无功能人血清 （CI-HS） 培养基。
      1. 要制备 5% CC-HS 培养基，将解冻的补体感受态人血清与 RPE-MM 以 1：20 稀释度混合。使用前通过0.22μm介质过滤器过滤溶液。
      2. 为了制备5%补体无功能人血清（CI-HS）培养基，首先在57°C水浴中加热灭活CC-HS30分钟，然后以1：20稀释度与培养基混合。使用前通过0.22μm介质过滤器过滤溶液。
   3. 血清用200μL5%CC-HS或5%CI-HS培养基处理细胞，总孵育时间为48小时，24小时后刷新培养基。
   4. 用1x DPBS洗涤细胞，并在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。 再次用1x DPBS洗涤并将样品储存在4°C，浸入200μLDPBS中。
   5. 可选：如果需要，从平板中裂解细胞以仅显示亚RPE脂质沉积。
      1. 要裂解细胞并仅留下脂质沉积物，请取出培养基并向每个孔中加入 200 μL 去离子水。
      2. 孵育10-15分钟，上下移液直至细胞被移除。用 200 μL 去离子水再次洗涤，并立即用 4% 多聚甲醛固定细胞。
      3. 使用Hoechst通过核染色确认细胞去除功效。以 1：2000 稀释度将 Hoechst 加入含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.5% 吐温 20 和 0.5% Triton-X 100 的 1x DPBS 溶液中。在室温下在黑暗中孵育1小时。随后，用 1x DPBS 洗涤。
2. iRPE的感光器外段（POS）治疗
   1. 收银机准备
      1. 从-80°C储存中取出POS颗粒管，并在4°C的有盖冰桶中解冻过夜。
      2. 通过将 10 g 蔗糖与 40 mL 双去离子 H 2 O （ddH₂O） 混合来制备 POS 洗涤缓冲液。
      3. 在40-50°C下加热混合物，同时轻轻搅拌15分钟。向混合物中加入840mg碳酸氢钠，并在加热10分钟时搅拌。
      4. 根据需要，用ddH₂O将POS洗涤缓冲液的总体积调节至100mL，并根据需要用1N HCl或1N NaOH将溶液的pH调节至8.3。使用0.22μm过滤器过滤洗涤溶液。
         注意：协议可以在此处暂停;POS洗涤缓冲液可以在4°C下储存过夜。
      5. 解冻后，将沉淀悬浮在 15 mL POS 洗涤缓冲液中。在颗粒悬浮期间要轻柔，以确保 POS 的完整性。将POS悬浮液在4°C下以600× g 离心20分钟，然后吸出上清液。
      6. 将 POS 沉淀重悬于 10 mL POS 洗涤缓冲液中。
      7. 取出 100 μL 等分试样的 POS + POS 洗涤缓冲液（POS 溶液），并在 400 μL 1x DPBS 中稀释。将 50 μL 稀释的 POS 溶液铺在血琼脂平板和琼脂糖平板上，以检查细菌和真菌污染物。为每个准备阳性对照，并在37°C下孵育所有板48小时。
      8. 通过在检测孔中加入 1 μL POS 溶液来检测支原体，从而进行 qPCR 测定。要扩增 DNA 片段，请执行 40 个变性循环（95°C，15 秒）以及退火和伸长循环（60°C，1 分钟）。用于检测POS样品中支原体的正向和反向引物如下：
         前向入门： GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
         反向引物：CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC
      9. 使用细胞分析仪测量POS浓度，并根据需要等分试样。对于一个带有RPE细胞的96孔板的孔，3 x 10⁶ POS就足够了。所需比率为 10 个 POS/RPE 单元。将等分试样储存在80°C以备将来使用。
   2. 将 POS 添加到单元格中
      1. 在冰浴中解冻POS小瓶。
      2. 将计算的制备量的POS与RPE-MM混合，并每天用POS处理细胞一次，持续7天。
         注意：每天准备新鲜的POS解决方案。
      3. 用1x DPBS洗涤细胞，然后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。 再次用DPBS洗涤并将样品储存在4°C，浸入200μLDPBS中。

5. 亚 RPE 沉积物的染色

1. 尼罗河红染色方案
   1. PFA固定后，用1x DPBS洗涤样品3次。
      注意：如果不立即使用，可以在此处暂停协议，但样品必须储存在4°C的1x DPBS + 0.02%叠氮化钠溶液中。
   2. 要制备尼罗河红储备溶液，请将尼罗红粉末溶解在丙酮中，浓度为 3 mg/mL。定期混合在室温下孵育15分钟。用0.22μm过滤器过滤溶液一次或两次，具体取决于溶液中残留的沉淀物水平。
      注意：保护储备溶液避光。
   3. 为了制备工作溶液，在1x DPBS中以1：500的比例稀释储备溶液。在摇床上向样品中加入 200 μL 工作溶液 30 分钟，并保护其免受光照。
   4. 用1x PBS洗涤3次，并将样品储存在4°C，浸入200μLDPBS中。
      注意：如果在Transwell而不是96孔板上进行实验，则可以将样品安装在带有安装介质的载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，并用透明指甲油密封。应注意将样品朝上安装。
2. BODIPY染色方案
   1. 对于储备溶液，将BODIPY溶解在无水二甲基亚砜（DMSO）中，以达到3.8mM的储备浓度。
   2. 对于PFA固定样品，在1x DPBS中以1：300的比例稀释BODIPY原液。向细胞中加入 200 μL，并在室温下在摇杆上孵育过夜。
   3. 用1x DPBS洗涤3次，并将样品储存在4°C，浸入200μLDPBS中。
      注意：如果在Transwell而不是96孔板上进行实验，则可以将样品安装在带有安装介质的载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，并用透明指甲油密封。应注意将样品朝上安装。
3. APOE 免疫染色方案
   1. 将 1x DPBS 与 1% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.5% 吐温 20 和 0.5% Triton-X 100 混合，制成缓冲溶液。
   2. 对于PFA固定样品，在室温下将样品在200μL缓冲溶液中封闭并透化1小时。
   3. 在缓冲溶液中加入以1：100稀释的APOE一抗，并在室温下孵育过夜。
   4. 第二天，用1x DPBS洗涤样品3次。
   5. 在缓冲溶液中以1：1000稀释度加入二抗，并在室温下向细胞中加入200μL溶液1小时。
   6. 用1x DPBS洗涤3次，并将样品储存在4°C，浸入200μLDPBS中。
      注意：如果在Transwell而不是96孔板上进行实验，则可以将样品安装在带有安装介质（Fluoromount）的载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，并用透明指甲油密封。应注意将样品朝上安装。

6. 图像自动化和处理

1. 自动图像扫描
   注：本研究使用了蔡司LSM 800倒置共聚焦扫描显微镜和ZEN 3.2（蓝色版）软件。确保在成像前将96孔板加热至室温至少60分钟，以避免在扫描过程中由于介质折射率随温度变化而变化而导致焦平面漂移。
   1. 使用共聚焦显微镜和40倍物镜，使用适当的荧光通道为所使用的脂质标志物和任何其他抗体创建扫描图谱。
   2. 使用 “磁贴 ”复选框设置图像自动化。要校准 96 孔板，请确保输入并选择正确的样品载体测量值。然后，单击 校准 按钮根据说明校准板，这需要使用10倍物镜。
   3. 选择“高级设置”视图以选择合适的孔，并使用“位置”功能在孔中心附近添加3个不同的成像点。这可以在“位置”子选项卡下手动完成，也可以使用“位置设置”选项卡并选择“按承运人设置”随机完成。对相同染色的所有孔重复此操作。
   4. 为了在自动化过程中获得最佳对焦和 Z 轴堆栈定位，请转到 焦点策略 选项卡以选择 使用由磁贴设置定义的焦点表面/Z 值。替代方法可以使用其他焦点策略，但建议使用此设置以获得最一致的结果。
   5. 在 “切片 ”选项卡下，单击 “验证 位置”，然后为每个位置手动设置中央 Z 平面。“ 选项” 子选项卡中的设置将按图像采集顺序，因此请在开始成像之前检查此项。要按选择位置的顺序获取图像，请取消选中“ 平铺区域/位置 ”和 “载体孔/容器 ”复选框。选择将 场景拆分为单独的文件 以简化图像处理。
   6. 确保将 “Z-Stack ”选项卡设置为“ 居中”，将范围输入到用户的首选项中，并选择 “最佳 ”按钮以设置切片间隔。
   7. 优化采集 模式、通道、聚焦策略、Z 堆栈和 图块 选项卡后，开始实验。
2. 图像处理
   1. 使用批量图像处理方法，使用 扩展焦深 方法创建每个 Z 堆栈的最大投影。
   2. 使用批处理图像处理方法，将最大投影文件导出为 16 位 TIFF 图像。将压缩设置为 “无 ”，并确保选中 “原始数据 ”。所得图像应仅为表达脂质标志物的荧光通道的最大投影灰度TIFF。

7. 细分和量化

注意：LipidUNet程序在96孔板的40倍图像上进行训练。强烈建议使用使用40倍物镜获得的图像。

1. 安装 LipidUNet 软件。LipidUNet可以从以下GitHub存储库下载：https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
2. 识别代表尼罗河红、Bodipy 或 APOE 的 TIFF 图像，并根据所使用的方法将它们移动到名为 Nile_Red、Bodipy 或 APOE 的目录中名为 imgs 的文件夹中。
   注意：LipidUNet 程序必须使用确切的命名约定才能识别目录。
3. 打开 LipidUNet 软件（图 4）。
4. 在软件的 “预测 ”选项卡中，通过单击省略号并导航到命名目录来选择相关目录（Nile_Red、Bodipy 或 APOE）。通过检查类条目来确认 LipidUNet 程序已正确识别图像。
5. 为算法选择介于 0.01 和 0.99 之间的概率阈值。较高的值将消除更多的误报，但可能会导致更多的漏报，较低的值可能会引入更多的误报，同时消除更多的漏报。默认值为 0.65，建议使用。
6. 单击 预测。
   注意：软件将自动循环访问所有映像，并在所选目录中创建一个名为predicted_masks的新文件夹。
7. 使用掩模分析工具循环访问生成的掩模，并提供来自 掩模 图像的阈值脂质沉积的定量计数。
8. 分析生成的计数数据以比较治疗条件。

图 4：LipidUNet 用户界面。 LipidUNet软件为训练数据目录选择不同的部分，其中脂质沉积物的图像已被正确识别;模型权重目录，该目录由训练数据生成;以及用户将在其中输入其图像以进行分割的预测数据目录。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

该协议提供了一种有效标记，成像和量化退行性眼病单基因和多基因 体外 疾病模型中脂质沉积的方法。基于人工智能的软件LipidUNet可应用于三种常见的脂质标志物，即APOE、Nile Red和BODIPY，并提供一种快速、自动的分析方法，使定量成为标准和无偏。

LipidUNet的主要局限性在于AI的训练数据集仅限于在96孔板中培养的细胞的40倍放大图像。作为训练图像集的结果，当前形式的LipidUNet仅限于分析40倍放大图像。该软件可用于分析除96孔板外在其他培养表面上培养的细胞的40倍图像，但应注意检查生成的输出掩模，以验证软件的准确阈值。需要更多的图像集（在不同的放大倍率下）来扩大它可以分析的样品/图像的范围。

该协议有几个关键步骤。在脂质标记步骤中，用户应确认他们选择的标记化合物（BODIPY，APOE，Nile Red）已有效标记其样品。成熟的RPE细胞通常色素沉着，这会损害抗体免疫染色的荧光信号。当荧光信号较弱或背景染色过多时，LipidUNet无法准确识别脂滴。出于类似的原因，必须使用正确选择协议自动成像步骤的采集设置。如果采集的图像质量较差，LipidUNet将难以正确屏蔽图像，因此定量将不准确（图6A-L）。最后，图像的后处理是一个重要的步骤，因为LipidUNet对软件的工作有特定的要求。

与使用手动阈值的脂质分析工作流程或斐济等软件中涉及自动阈值分析的技术相比，LipidUNet 在具有可变脂质沉积的图像中提供了无偏且可靠的分割，这反映在脂质颗粒鉴定中的小错误率（图 7）。该软件允许用户输入额外的训练图像，允许分析超出使用40倍放大镜的图像集，甚至是使用不同脂质标志物的图像集，如协议中所述。将来，该软件将被训练以分析3D图像，以便可以量化脂质沉积体积。将脂质沉积视为病理学主要因素的退行性眼病很普遍，随着老年人口的增加，预计病例还会增加¹³。正如我们在本协议中概述的那样，准确的疾病模型和有效的分析工具将允许开发新的治疗干预措施。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip filter system	EMD Millipore	SCGP00525
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma	T5516
Albumin Bovine, Fraction V	MP Biomedical	160069
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)	Invitrogen	A21431	APOE secondary antibody
APOE primary antibody	Millipore Sigma	AB947
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Protect from light
Complement competent human serum	Millipore Sigma	S1-LITER
CTS N2 Supplement	Life Technologies	A13707-01
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Slide mounting media
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm	Electron Microscopy Sciences	72204-01
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick	Electron Microscopy Sciences	71870-01
Hydrocortisone	Sigma	H0396
MEM Alpha	Life Technologies	12571-063
MEM non-essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Nile Red	Sigma	72485-100MG	Protect from light
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Strep	Life Technologies	15140-148
Phosphate Buffered Saline 10x	Gibco	70011-044
Rod Outer Segments (OS)	InVision Bioresources	98740
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360-070
Sucrose	Sigma Aldrich	S1888
SYBR Green Master Mix	Bio-Rad	1725274
Taurine	Sigma	T0625
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Tween 20 Ultrapure	Affymetrix	9005-64-5
Vitronectin	Life Technologies	A14701SA
Y-27632 dihydrochloride	R&D Systems	1254