使用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒生产过程中发酵Traminette葡萄的细菌群落

摘要

在这里，我们提出了一种描述扩增子宏基因组的方案，用于确定Traminette葡萄，发酵葡萄和最终葡萄酒的细菌群落。

摘要

测序技术的进步以及使用生物信息学工具分析微生物群落结构的相对容易获得，有助于更好地了解葡萄和葡萄酒中可培养和不可培养的微生物。在工业发酵过程中，已知和未知的微生物通常负责产品开发和异味。因此，分析从葡萄到葡萄酒的细菌可以很容易地理解原位微生物动力学。在这项研究中，Traminette葡萄的细菌必须经过发酵，最终的葡萄酒经过DNA提取，产生15 ng/μL至87 ng/μL。对V4区高变区的16S扩增子进行测序，相对丰富的细菌由变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门组成，其次是疣微生物群、盐杆菌门、脱硫杆菌门、粘菌门和酸杆菌门。对共享的独特操作分类单元 （OTU） 的维恩图分析显示，葡萄汁、发酵阶段和最终葡萄酒共有 15 个细菌门。使用16S扩增子测序检测了以前未报道的门，以及肠杆菌科和乳杆菌科等属。测试了葡萄酒中有机营养素利用的变化及其对细菌的影响;含有 Fermaid O 和 Traminette L 的 Traminette R 罐用 Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O 刺激。 使用 Kruskal-Wallis 检验确定均匀度的 Alpha 多样性。β多样性表明两种处理的细菌在发酵阶段发生了变化，最终的葡萄酒细菌看起来相似。该研究证实，16S扩增子测序可用于监测葡萄酒生产过程中的细菌变化，以支持葡萄酒生产过程中葡萄细菌的质量和更好的利用。

引言

Traminette葡萄的特点是生产出卓越的葡萄酒质量，此外还有可观的产量和对几种真菌感染的部分抵抗^力1,2,3。葡萄的自然发酵依赖于相关的微生物、葡萄酒生产环境和发酵容器^4,5。通常，许多酿酒厂依靠野生酵母和细菌进行发酵、酒精生产、酯类、香气和风味开发⁶.

本研究的目的是检查葡萄的细菌组成并监测其在发酵过程中的动态。虽然，现代使用酿酒酵母等发酵酵母进行初级发酵，生产酒精，在不同的葡萄酒风格^{中很常见 7}.此外，二次发酵，其中苹果酸被Oenococcus oeni脱羧为乳酸，改善了葡萄酒的感官和味道特征，并降低了葡萄酒的酸度^8,9。随着使用不依赖培养的方法的最新进展，现在可以确定与酿酒葡萄相关的不同微生物，以及转移到葡萄汁并在不同时间参与发酵的物种，直到最终产品¹⁰。

研究方案

1. 实验性葡萄酒生产

1. 从北卡罗来纳州琼斯维尔的 Dynamis Estate 葡萄酒中获取 Traminnette 葡萄，去梗并压碎以释放葡萄汁到两个独立的 600 升开顶发酵罐中，并在盖子上放置约 4 天。
2. 每天将瓶盖打孔一次，以保持皮肤湿润并限制挥发性酸 （VA） 的产生。
   注意：这个想法是许多芳香前体（单萜烯）位于果皮中，并使果汁与果皮接触，以增加葡萄酒的芳香潜力。
3. 4 天后，投放酿酒 酵 母 var cerevisiae QA23 （Lallemand）。之所以选择这种酵母，是因为它是一种强大的发酵罐，并且与增强葡萄葡萄酒的品种特性有关。
4. 在一个罐Traminette R中，当白利糖度为17.7时加入20 g/hL Fermaid O，在13.1 g/hL时加入20 g/hL Fermaid O和12.5 g/hL Fermaid K，以实现发酵安全性，而另一个罐Traminette L，当白利糖度为17.1时，加入40 g/hL Stimula Sauvignon blanc。当白利糖度为13.4时，还可以添加20 g/hL Fermaid O，以增强葡萄酒的品种特性。
5. 取葡萄汁（第1天），添加酵母（第4天），发酵葡萄汁（第15天）和成品酒样品（第30天）的重复样品，并在DNA提....

讨论

宏基因组学的方案从葡萄汁的取样开始，当酵母被添加到葡萄汁中时，发酵的葡萄酒和最终的葡萄酒样品。随后从这些样本中成功提取了重复的DNA。获得的量浓度从15 ng/μL到87 ng/μL不等。这表明DNA提取方案对葡萄酒的宏基因组研究是有效的。尽管 A260/A280 的 DNA 质量各不相同，但这可能归因于可能影响提取的不同参数，例如酒精浓度和发酵过程中和发酵后产生的其他发酵代谢物，以及其他可能抑制.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation